小麦TaSAP1基因的内含子TaSAP1in1序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体是一种小麦TaSAP1基因的内含子TaSAP1in1序列及其应用。本发明专利技术内含子TaSAP1in1的核苷酸序列，如SEQ No. 1所示，序列长度为152 bp，AT含量为38.16%。本发明专利技术的目的是提供一种增强外源基因表达的内含子序列及其用途,即分离自小麦TaSAP1基因5’非翻译区的内含子TaSAP1in1,所述内含子TaSAP1in1与启动子组合后,使外源基因能够在植物组织中高效表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体是一种小麦TaSAP1基因的内含子TaSAP1in1序列及其应用。
技术介绍
作物转基因育种面临的一个基本问题是如何精细地调控外源基因的表达。植物在长期进化过程中，形成一套复杂精细的基因调控网络，能够在转录、转录后、翻译及翻译后等多水平调控基因的表达。因此，若要精细地调控外源基因的表达，须在多个水平实施调控。真核生物内含子可以在转录、转录后和翻译等多个水平影响基因表达，是优化外源基因表达的重要元件。真核生物绝大多数基因是由不连续DNA序列组成的断裂基因，内含子是断裂基因中的非编码序列，在形成成熟mRNA过程中被精确切除。内含子的一个基本功能是通过选择性剪接丰富蛋白质的多样性，该现象最早在研究猿猴病毒(SV40)时发现，研究人员通过构建类似的病毒体系发现内含子的剪接还可显著影响mRNA表达水平。在植物中，内含子介导基因表达的增强作用也受到广泛关注，例如玉米Hsp82、Sh1、Adh1、GapA1 1(Callis et al.1987；Clancy and Hannah2002；Donath et al.1995；Sinibaldi and Mettler 1992；Wang et al.2008)和Ub1，水稻OsPB-73、rubi3、OsTub6(Chen and Wang 2004；Giani et al.2009；Samadder et al.2008)，拟南芥MHX、PUX7、PYM、PhADF1(Akua and Shaul 2013；Gallois et al.2013；Mufarrege et al.2011)等。不同内含子增强基因表达的程度差异较大，普遍在2-10倍，但也有例外，如玉米基因sh1第一内含子在玉米和水稻原生质体中可增强报告基因表达约100倍(Maas et al.1991)。内含子增强基因表达效应的大小与其所处位置相关，一般认为靠近基因编码区5′端的内含子增强效应较大，如基因的第一内含子和5′非翻译区内含子。内含子增强基因表达的调控方式为人们研究其功能提供了新的切入点，同时也为在转基因育种中优化外源基因的表达提供了新途径。在基因工程研究中，目的基因表达的强弱可能会对受体植株的表型产生巨大影响，因此，对基因表达强弱的控制往往是基因工程实验成败的关键因素之一。外源基因嵌入新的受体植物后，受不同遗传背景的影响，并不总能高效率的表达，内含子原则上可以对此进行调节，而利用内源性的内含子是最佳选择，目前，小麦中可用于调节基因表达的内含子很少，因此，发掘这类内含子对于转基因的精细调控及转基因安全性都具有重要意义。植物SAP(Stress Associatied Protein)家族指的是一类具有A20/AN1锌指结构域的逆境相关蛋白。目前，许多植物中都有关于这类基因的研究报道，如水稻、拟南芥、番茄、蒺藜苜蓿、香蕉等。小麦TaSAP1基因参与了小麦对低温、干旱、盐胁迫等逆境的响应，在拟南芥中过量表达可以增强植株抵抗干旱、高盐和渗透剂等胁迫的能力(王彩香,2011)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种增强外源基因表达的内含子序列及其用途,即分离自小麦TaSAP1基因5’非翻译区的内含子TaSAP1in1，所述内含子TaSAP1in1与启动子组合后,使外源基因能够在植物组织中高效表达。本专利技术内含子TaSAP1in1的核苷酸序列，如SEQ No.1所示，序列长度为152bp，AT含量为38.16％。本专利技术所述的内含子TaSAP1in1还包括SEQ No.1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸所衍生的具有相同功能的核苷酸序列。本领域技术人员可将本专利技术内含子TaSAP1in1序列用于构建表达载体。可将内含子TaSAP1in1序列置于启动子上游，构建得到表达盒，然后将该表达盒插入植物表达载体中，获得含有本专利技术内含子TaSAP1in1的表达载体。因此，本专利技术还包括由上述内含子构建的表达盒或表达载体。本专利技术内含子TaSAP1in1序列可用于转基因植物的制备。例如，利用农杆菌介导、花粉管通道以及基因枪法将整合有本专利技术内含子序列的表达盒导入受体植物，其中表达盒中的目的基因可以是抗虫、抗旱或其他逆境相关的外源或内源基因。受体植物可为双子叶植物(拟南芥)或单子叶植物，优选植物为单子叶植物，如小麦、水稻、玉米、高粱等。本专利技术还提供了所述内含子TaSAP1in1与启动子组合后在转基因植物中驱动外源基因高效表达的应用。具体实验为：将本专利技术内含子TaSAP1in1序列与CaMV35S启动子搭配，并于下游GUS基因融合构建成表达载体，并转化拟南芥。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定表明本专利技术提供的内含子TaSAP1in1序列能够增强CaMV35S启动子活性约3倍，是一种新的可用于植物基因工程中增强外源基因表达的内含子序列。所述的植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥、小麦、水稻、玉米或高粱。附图说明图1 TaSAP1 5’非翻译区内含子TaSAP1in1的克隆。图中箭头所示为内含子TaSAP1in1片段。图2 TaSAP1 5’非翻译区内含子TaSAP1in1表达载体的构建过程示意图。图3 TaSAP1 5’非翻译区内含子TaSAP1in1载体构建片段酶切检测图。箭头所示为从载体上酶切下来的内含子TaSAP1in1片段。图4 拟南芥阳性植株的筛选图。图中箭头所示为经潮霉素B筛选后获得的阳性植株。图5 转基因拟南芥幼苗GUS染色分析结果对比图。图中1表示野生型拟南芥；2表示的拟南芥含有pCAMBIA1300-221(含CaMV35S启动子)表达载体；3表示的拟南芥含有pCAMBIA1300-221+TaSAP1in1(含TaSAP1in1+CaMV35S启动子)表达载体.由图可知：转pCAMBIA1300-221+TaSAP1in1的GUS组织化学染色要明显深于转pCAMBIA1300-221的拟南芥植株，表明TaSAP1in1增强了CaMV35S的启动活性。图6 TaSAP1 5’非翻译区内含子TaSAP1in1对CaMV35S启动子活性的增强作用(整株比较)。图7 TaSAP1 5’非翻译区内含子TaSAP1in1对CaMV35S启动子活性的增强作用(不同组织器官比较)具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术实质的情况下，对本专利技术的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的试剂如无特殊说明，均为常规配方。小麦TaSAP1 5’非翻译区内含子TaSAP1in1的克隆根据已有的TaSAP1 5’非翻译区序列，利用Primer Premier5.0设计引物，正向引物(TaSAP1in1F)：5'AGCTGTTAGTACCCCTACCCTCCCC 3'，反向引物(TaSAP1in1R)：5'ACGCTGCAGAGAGACCCAACAAAAA3'，引物中加粗部分为保护碱基，下划线部分为引入的酶切位点，分别为XbaI和SmaI，以含有本专利技术内含子TaSAP1in1序列的质粒载体(TaSAP1in1序列来自小麦旱选10号，详见文献Cha本文档来自技高网...

【技术保护点】
小麦TaSAP1基因的内含子TaSAP1in1序列，其特征在于，是如（a）或（b）所示的核苷酸序列：（a）是由SEQ No. 1所示的核苷酸序列；（b）将SEQ No. 1所示的经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸所衍生的具有相同功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.小麦TaSAP1基因的内含子TaSAP1in1序列，其特征在于，是如（a）或（b）所示的核苷酸序列：（a）是由SEQ No. 1所示的核苷酸序列；（b）将SEQ No. 1所示的经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸所衍生的具有相同功能的核苷酸序列。2.含有权利要求1所述内含子TaSAP1in1的表达盒或表达载体。3.权利要求1所述内含子TaSAP1in1序列、权利要求2所述表达盒或表达载体在制备转基因植物中的应用。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：常建忠，闫凤霞，乔麟轶，董春林，郑军，雷梦林，张明义，杨睿，杨丽莉，张彦琴，
申请(专利权)人：山西省农业科学院旱地农业研究中心，
类型：发明
国别省市：山西;14