本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，提供了两个受玉米纹枯病菌诱导的顺式作用元件及其应用，这两个元件来源于纹枯病抗病相关基因GRMZM2G315431上游的启动子序列，具体应用时将绿色荧光蛋白基因和这两个元件的顺式串联重复融合后得到重组DNA，转化水稻得到新的转基因植物。在转基因水稻中绿色荧光蛋白基因的表达受纹枯病菌侵染的调控；这样就可以利用本发明专利技术顺式作用元件构建植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物对纹枯病的抗性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程
，提供了两个玉米纹枯病菌诱导顺式作用元件，可用于通过植物基因工程技术改善植物对纹枯病的抗性。
技术介绍
由真菌、细菌、病毒以及线虫引起的植物疾病为作物生产带来巨大影响。植物拥有两套不同的抗性机制：一是被动防御机制，是指一些抗性相关的形态结构，如表皮和坚硬的细胞壁(Brady JD,Fry S.Formation of di-isodityrosine and loss of isodityrosine in the cell walls of tomato cell-suspension cultures treated with fungal elicitors or H2O2.Plant Physiol 1997,115:87-92.)。另一个是主动防御，主动防御是抗性基因与病原菌识别并且互作引起的。病原物无毒基因(avr)编码的激发子与寄主植物响应的抗病基因(R)编码激发子的受体分子相互作用产生抗病反应。植物抗病防卫反应一般经历信号识别、信号传导、防卫基因表达三个环节。主动防御中所有类型的抗病机制都要依靠防卫基因表达，抵抗的有效性取决于基因表达的时空特性。正是由于防卫基因的时空表达特性，其启动子往往具有某些特殊的顺式作用元件，人们可以利用防卫基因、尤其是其顺式元件为基因工程改良提供有利的工具。植物中绝大部分抗病基因都编码具有核苷酸结合位点以及亮氨酸重复的蛋白(NBS-LRR)，(McHale L,Tan X,Koehl P,Michelmore RW.Plant NBS-LRR proteins：adaptable guards.Genome Biol 2006,7:212.)。但是对于这类基因的启动子研究还比较少。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5端上游区的DNA序列，是转录调控的中心。从1983年第一株转基因植物问世以来，启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节特性；诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达。这些启动子的最大优点是：它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。目前，已经找到一些组织特异性或诱导表达启动子，并发现其上存在的相应的顺式因子，为后来的启动子研究奠定了基础。烟草的Sar8.2b基因受水杨酸(SA)诱导，在其启动子上发现了几个顺式作用因子，包括as-1因子、GT21和Dof结合序列。SA诱导Sar8.2b基因表达可能存在于-728至-927bp和-197至-351bp的区域的顺式因子中(Song F,Goodman RM.Cloning and identification of the promoter of the tobacco Sar8.2b gene,a gene involved in systemic acquired resistance.Gene 2002,290:115-124.)。玉米蔗糖合成酶I只在韧皮部细胞中表达(Yang NS,Russell D.Maize sucrose synthase-promoter directs phloem cell specific expression of gus gene in transgenic tobacco plants.Proc Natl Acad Sci 1990,87:4144-4148.)。PsGNS2启动子只在种子中特异表达(Buchner P,Rochat C,Wuilleme S,Boutin JP.Characterization of a tissue-specific and developmentally regulated beta-1,3-glucanase gene in pea(Pisum sativum).Plant Mol Biol 2002,49:171-186.)。玉米是最重要的粮食作物之一，玉米的真菌病害以及细菌病害都会造成产量减少及品质下降。玉米抗病基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解寄主与病原菌的互作并为基因工程改良奠定基础。因此如何利用玉米抗病基因的克隆以及启动子的分离获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。专利技术人在ZL201410104914.2中公开了一个玉米病原菌诱导启动子pGRMZM2G315431，该启动子能够被玉米纹枯病菌YWK-196,水稻白叶枯病病菌及细菌性条斑病病菌激活，但是针对该启动子的具体功能分析现有技术中还未做出，无法揭示其更深层的性质和功能。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的情况，特别是在ZL201410104914.2中公开技术的基础上，获得了两个受玉米纹枯病菌诱导的顺式作用元件，这两个元件均能够响应纹枯病菌侵染而不能被水稻白叶枯病病菌和细菌性条斑病菌激活,可见这两个元件是纹枯病菌特异性诱导调控元件，可以利用本专利技术调控元件构建成各种植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物对纹枯病的抗性。专利技术人在ZL201410104914.2公开的技术上，针对GRMZM2G315413启动子-1243至-1228区域进行截短，确定了-1243至-1239和-1232至-1228这两段序列均为响应纹枯病菌侵染的作用元件，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将其在水稻中稳定表达后发现，这两个作用元件仅能够被纹枯病菌激活，而不能被白叶枯病菌和细菌性条斑病菌激活。在此基础上，专利技术人利用绿色荧光蛋白基因和这两个元件的顺式串联重复融合后得到重组DNA，转化水稻得到新的转基因植物，实验证实在转基因水稻中绿色荧光蛋白基因的表达受纹枯病菌侵染的调控；由于本领域中绿色荧光蛋白基因作为一种可视化的标记基因，在启动子及调控元件研究中是一种普遍使用的标记基因，可以根据其验证调控元件的功能，基于这一情况，可证明完全可以利用本专利技术顺式作用元件构建植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物对纹枯病的抗性。综上所述，本专利技术的专利技术人提供了两个受纹枯病菌特异诱导的作用元件，其功能研究有助于揭示GRMZM2G315431基因的表达调控机理，并拓宽了启动子及作用元件在基础研究和抗病基因工程中的应用。附图说明图1为GRMZM2G315413启动子-1243至-1228区域截短片段在烟草中瞬时表达后受到纹枯病菌诱导GFP荧光观察及定量分析结果灰度图；图中a为-1243至-1228截短示意图；b为各截短片段病原诱导活性GFP荧光检测结果；c为各截短片段病原诱导活性GFP定量分析结果；其中不接菌为对照，接种24h后进行荧光观察及定量检测，结果发现-1243至-1239和-1232至-1228片段能够被纹枯病菌激活，说明这两段序列为纹枯病菌诱导元件；图2为本专利技术所述作用元件在烟草中瞬时表达后受到纹枯病菌诱导GFP荧光观察及定量分析结果灰度图，图中a为调控元件病原诱本文档来自技高网...
【技术保护点】
受玉米纹枯病菌诱导的顺式作用元件，其特征在于：其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.受玉米纹枯病菌诱导的顺式作用元件，其特征在于：其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示。2.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，丁新华，储昭辉，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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