通过发酵法从碳源制备苯胺衍生物的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过发酵法从葡萄糖这样的碳源制备苯胺衍生物的方法。所述苯胺衍生物的制备方法包括以下的工序：在具有从分支酸合成4‑氨基苯丙酮酸功能的微生物中，通过导入至少三个外来基因，在规定培养条件下，制作能够生产1.8g/L以上4‑氨基苯丙氨酸(4APhe)的微生物；然后在适于该微生物的繁殖和/或维持的条件下，使该微生物与碳源接触，制备选自由4‑氨基苯丙氨酸(4APhe)、4‑氨基肉桂酸(4ACA)、2‑(4‑氨基苯基)醛、4‑氨基苯基乙酸、以及4‑氨基苯乙基乙醇(4APE)组成的组中的至少一种苯胺衍生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过发酵法从碳源制备苯胺衍生物的方法。更详细而言，本专利技术涉及利用基因工程的手法，制作被赋予了从分支酸生物合成4-氨基苯丙酮酸的功能的微生物，通过利用了这样的微生物的发酵法，从葡萄糖这样的碳源制备选自由4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)组成的组中的至少一种苯胺衍生物的方法。
技术介绍
近年来，以由来自石油的二氧化碳造成的地球变暖问题为开端，要改变过度依赖石油的社会结构的势头在世界中日益增高。随着这样的潮流，活用生物工艺的“生物精炼”的活动日渐活跃化，在世界各国正在加速研究，但遗憾的是，实际情况是几乎仍未获得与芳香族化合物的生物合成有关的研究成果，鉴于化学产业的芳香族化合物的重要性，人们正在积极推进芳香族聚合物合成等研究。例如，在以下的专利文献1中，公开了与使用作为天然分子的4-氨基肉桂酸(4ACA)的聚合物合成有关的技术，报告了从4-氨基肉桂酸可以获得高耐热聚合物。此外，如以下的非专利文献1所公开的那样，关于4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生物合成，经由莽草酸的代谢路径变得清楚(参照本文件第2818页Fig.1)，但是并没有公开脱氨酶在生物体内发挥作用、从4-氨基苯丙氨酸向4-氨基肉桂酸转化的内容，也没有这方面的启示。在以下的非专利文献2中记载了以下内容：将酵母粘红酵母JN-1(Rhodotorulaglutinis)的苯丙氨酸脱氨酶(以下，简称为Rgpal)的基因分离，该酵母以保藏编号M2011490被保藏于CCTCC(ChinaCenterForTypeCultureCollection、中国典型培养物保藏中心)，此外，记载了通过该基因的定点诱变制作最适pH变异体。而且，由于以非专利文献2的作者等为专利技术人的中国专利申请说明书(以下的专利文献2)于2013年4月24日被公开发表，因此这样的Rgpal的序列本身是公知的。然而，并没有公开这样的酶将4-氨基苯丙氨酸作为基质可以生成4-氨基肉桂酸的内容。如此，在作为4-氨基肉桂酸(4ACA)的前体方面，4-氨基苯丙氨酸(4APhe)是重要的物質。此外，在以下的非专利文献3中，如图1所示，公开了分支酸通过PapA(4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶)被转化为4-氨基-4-脱氧分支酸(ADC)，ADC通过PapB(4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶)被转化为4-氨基-4-脱氧预苯酸(ADP)，ADP通过PapC(4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶)被转化为4-氨基苯丙酮酸。此外，可以认为4-氨基苯丙酮酸通过微生物的内源性酶的作用被转化为4-氨基苯丙氨酸(4APhe)。此外，在以下的专利文献3中公开了以下内容：至少通过属于氨基脱氧分支酸合成酶的类别的酶的进行催化的、4-氨基-4-脱氧分支酸(ADC)的生物合成获得含有4-氨基-4-脱氧分支酸(ADC)及4-氨基-4-脱氧预苯酸(ADP)的发酵培养液，同时在提高了活性水平的、具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的宿主微生物体内，通过发酵来进行，并且这些化合物以一起或单独的任一种方式，从发酵培养液回收。然而，在单纯使用现有已知的pap系基因，即，抗生素生产路径中已知的三种关键酶(例如，委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)的PapA、PapB、PapC)的情况下，发酵法的4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生产率不超过0.2g/L左右，即使对现有已知的pap系的组合进行各种研究，充其量也只是停留在0.9g/L左右。在通过发酵法从葡萄糖等碳源工业性地大量地制备包含4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的苯胺衍生物时，这样低的产量就成了阻碍(参照图1)。如上所述，通过发酵法从葡萄糖等碳源通过发酵法能够工业性地大量地获得包含4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的苯胺衍生物的制备方法尚未确立，并且强烈地希望有这样的开发。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2013/073519号专利文献2：CN103060352A说明书专利文献3：日本特表2008-501326号公报非专利文献非专利文献1：He,etal.,Microbiology(2001)非专利文献2：Zhou,etal.,BiotechnolLett(2013)35:751-756非专利文献3：J.AM.CHEM.SOC.2003,125,935-939
技术实现思路
专利技术所要解决的问题如上所述，在单纯使用现有已知的pap系基因，即，抗生素生产路径中已知的三种关键酶(例如，委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)PapA、PapB、PapC)的情况下，发酵法的4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生产率不超过0.2g/L左右，即使对现有已知的pap系的组合进行各种研究充其量也只是停留在0.9g/L左右。本申请的专利技术人等将与4-氨基肉桂酸(4ACA)合成有关的酶基因导入使用现有的pap系基因的、生产0.2～0.9g/L的4APhe的转化体，但是并不能合成4ACA。鉴于这样的现有技术的现状，本专利技术所要解决的问题是提供一种苯胺衍生物的制备方法，该制备方法能够通过发酵法从葡萄糖这样的碳源工业性地大量地获得包括4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的苯胺衍生物。用于解决问题的方案本申请专利技术人等为了提高4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生产率，使用基因数据库探索了编码与委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)的PapA、PapB、PapC具有同源性的蛋白质的新型pap样基因之后，与大肠杆菌属于相同变形菌门的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescence)SBW25菌株(DeLeijFetal.(1995)ApplEnvironMicrobiol61:3443-3453)PFLU1770、PFLU1771、PFLU1772分别显示了34％(PapC)、44％(PapA)、28％(PapB)的所述同源性，制作使这些基因表达的重组大肠杆菌并供于4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的发酵，极大地提高了生产率，能够生产1.8g/L的4APhe。即，是在现有技术中不能达成4APhe的克级生产的技术。令人惊奇的，如上所述，即使将与4-氨基肉桂酸(4ACA)合成有关的酶基因导入使用现有的pap系基因的、生产0.2～0.9g/L的4APhe的转化体中，也不能合成4ACA，但是在将该酶基因导入生产1.8g/L的4APhe的转化体的情况下，能够首次合成4ACA。本申请专利技术人等推测：大肠杆菌中的从分支酸到4-氨基丙酮酸的转化在现有技术中不能高效率地进行，但通过这样的基因改変，变得能够高效率地进行该转化，其结果是，4APhe的产量提高，通过使4APhe的产量超过阈值，能够实现现在不能达成的4ACA的制备。基于这样的发现，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苯胺衍生物的制备方法，其中，所述制备方法包括以下的工序：在具有从分支酸生物合成4‑氨基苯丙酮酸功能的微生物中，通过导入至少三个外来基因，在规定培养条件下，制作能够生产1.8g/L以上4‑氨基苯丙氨酸(4APhe)的微生物；然后在适于该微生物的繁殖和/或维持的条件下，使该微生物与碳源接触，制备选自由4‑氨基苯丙氨酸(4APhe)、4‑氨基肉桂酸(4ACA)、2‑(4‑氨基苯基)醛、4‑氨基苯基乙酸、以及4‑氨基苯乙基乙醇(4APE)组成的组中的至少一种苯胺衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.20 JP 2014-0585701.一种苯胺衍生物的制备方法，其中，所述制备方法包括以下的工序：在具有从分支酸生物合成4-氨基苯丙酮酸功能的微生物中，通过导入至少三个外来基因，在规定培养条件下，制作能够生产1.8g/L以上4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的微生物；然后在适于该微生物的繁殖和/或维持的条件下，使该微生物与碳源接触，制备选自由4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)组成的组中的至少一种苯胺衍生物。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少三个外来基因是papA、papB、以及papC。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述papA、papB、以及papC分别来自荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescence)。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述p...

【专利技术属性】
技术研发人员：小西一诚，高谷直树，桝尾俊介，
申请(专利权)人：国立研究开发法人科学技术振兴机构，
类型：发明
国别省市：日本;JP