小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法技术

本发明专利技术涉及合成生物学染色体合成领域，特别涉及小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法。本发明专利技术将多个长约3kb的小片段DNA共转化至酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母自身高效的同源重组特性，实现对不大于30kb酿酒酵母V号染色体的替换工作，替换的正确性通过PCR的方法进行验证。能够快速替换大片段真核生物染色体、并使之能够发挥正常功能的大片段DNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及合成生物学染色体合成领域，特别涉及小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法。
技术介绍
生物基因组携带了决定生物基本性状的遗传信息，人工DNA合成技术和DNA大片段操作技术推动了基因组人工合成研究的进步。合成生物学的发展推动了通过人工设计合成来“写”基因组信息标志着“人造生命”的开始。近年来，丙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、X174噬菌体、T7噬菌体、水稻(Oryzasativa)叶绿体和小鼠(Musmusculus)线粒体等基因组序列先后实现了人工改造与合成,尤其是活性人工基因组设计与合成的成功使人工基因组合成工作受到了世界的极大关注,即支原体基因组和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)染色体的合成。Venter研究组开发了体外组装和酵母体内组装相结合的方式进行基因组合成，于2008年实现了生殖支原体(Mycoplamagenitalium)基因组的全化学人工合成,然后利用基因组转移的技术于2010年将人工合成的蕈状支原体(Mycoplasmamycoides)基因组转入移除自身染色体的山羊(Capraaegagrushircus)支原体(Mycoplasmacapriolum)细胞中,得到了能够发挥正常功能的全新的支原体细胞。2011年,Boeke研究组分别对酿酒酵母Ⅵ号染色体左臂和Ⅸ号染色体右臂进行了人工设计,并于2014年成功合成了具有生物学活性的完整Ⅲ号人工染色体,标志着基因组人工合成工作进入真核生物领域。生物染色体的长度较长，尤其是真核生物。通过体外或体外组装和染色体转移的技术来合成全新的、能够发挥正常功能的真核生物染色体困难极大，操作可行性较小。因此，一种能够快速替换大片段真核生物染色体、并使之能够发挥正常功能的大片段DNA替换技术显得极具开发价值。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法。本专利技术的目的是为了解决不大于30kb大片段酿酒酵母V号染色体的替换问题，提出利用多个小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法，多个小片段DNA共转化入酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母的同源重组特性，实现大片段DNA的替换。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中所述小片段DNA为不大于4kb的DNA；所述大片段DNA为不大于30kb的DNA。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中相邻两个所述小片段DNA之间存在不大于750bp的重叠区域。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中采用两个筛选标记尿嘧啶(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的组合物或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的组合对所述大片段DNA的替换进行表型表征。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中所述大片段DNA为酵母染色体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中所述大片段DNA为酵母V号染色体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中所述小片段DNA选自如SEQIDNo.1～SEQIDNo.17所示的的核苷酸序列。本专利技术提供了所述方法制得酿酒酵母菌株。本专利技术还提供了一种组合物，包括小片段DNA；所述小片段DNA为不大于4kb的DNA；相邻两个所述小片段DNA之间存在不大于750bp的重叠区域；多个小片段DNA共转化入酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母的同源重组特性，实现大片段DNA的替换。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述组合物中所述小片段DNA选自如SEQIDNo.1～SEQIDNo.17所示或如SEQIDNo.86～SEQIDNo.103所示的的核苷酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述组合物中还包括酿酒酵母细胞和/或筛选标记；所述筛选标记为尿嘧啶(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的组合或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的组合。本专利技术还提供了一种试剂盒，包括所述的组合物。本专利技术还提供了所述的组合物或所述的试剂盒在制备合成型染色体中的应用。本专利技术的基本思想是利用酿酒酵母同源重组的特性，通过共转化多个小片段DNA实现对大片段酿酒酵母V号染色体的替换。本专利技术对比已有成果具有以下有益效果：利用小片段DNA对大片段酿酒酵母V号染色体进行替换；利用PCR方法对替换结果进行快速验证。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示本专利技术得利用小片段DNA共转化替换不大于30kb大片段酵母V号染色体策略示意图；利用酿酒酵母自身的高效同源重组特性，多个不大于4kb小片段DNA被共转化至酿酒酵母细胞中将不大于30kb大片段酵母V号染色体进行替换；图2示本专利技术实施例1中PCR验证不大于30kb大片段酵母V号染色体替换正确的电泳图；替换正确后，SYN-PCR出现条带，WT-PCR不出现条带；图3示本专利技术实施例2中PCR验证不大于30kb大片段酵母V号染色体替换正确的电泳图；替换正确后，SYN-PCR出现条带，WT-PCR不出现条带；图4为实施例2中V号酿酒酵母菌株与野生型酿酒酵母菌株BY4741生长曲线比较图；其中，线1示空白对照，线2示BY4741，线3示替换后菌株。具体实施方式本专利技术公开了小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术的核心专利技术点是将多个不大于4kb的小片段DNA共转化至酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母自身高效的同源重组特性，实现对不大于30kb酿酒酵母V号染色体的替换工作，替换的正确性通过PCR的方法进行验证。关键步骤：将～15个长约3kb的小片段DNA共转化至酿酒酵母细胞中对V号染色体进行替换，每两个相邻小片段DNA之间存在一个不大于750bp的重叠区域，然后利用抗性标记或营养标记筛选和PCR验证确保对不大于30kb酿酒酵母V号染色体替换的正确性。构建策略图见图3。本专利技术的目的是通过下属技术方案实现的：1.多个不大于4kb小片段DNA被共转化至酿酒酵母细胞中，每两个相邻小片段DNA之间存在一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法，其特征在于，多个小片段DNA共转化入酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母的同源重组特性，实现大片段DNA的替换。

【技术特征摘要】
1.小片段DNA共转化替换大片段DNA的方法，其特征在于，多个小片段DNA共转化入酿酒
酵母细胞中，利用酿酒酵母的同源重组特性，实现大片段DNA的替换。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小片段DNA为不大于4kb的DNA；所述大
片段DNA为不大于30kb的DNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，相邻两个所述小片段DNA之间存在不大
于750bp的重叠区域。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，采用两个筛选标记尿嘧啶
(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的组合或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的组合对所述大片
段DNA的替换进行表型表征。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述大片段DNA为酵母染色体。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述大片段DNA为酵母V号染色
体。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述小片段DNA选自如SEQID
No.1～SEQIDNo.17所示或如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，谢泽雄，吴毅，李炳志，王霞，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12