一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法技术

本发明专利技术提出了一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，通过先用引物合成一级片段，再进行二级片段组装，最后组装成最终的DNA序列。本方法合成的DNA片段具有合成质量稳定，不受DNA复杂性和GC含量干扰，能够合成超长的DNA片段，稳定合成30kb以内的DNA片段，满足了现代分子实验的需求。

Efficient in vitro synthesis method of long fragment and complex fragment DNA

The invention provides an efficient in vitro synthesis method for a long fragment and a complex fragment DNA, which is first synthesized by using a primer, and then is assembled by a two stage fragment, and finally assembled into a final DNA sequence. The method of synthesizing DNA fragment with the synthesis of stable quality, not by DNA complexity and the content of GC interference, can synthesize long DNA fragments, stable synthesis of 30KB within the DNA fragment, to meet the needs of modern molecular experiments.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法。
技术介绍
DNA体外人工合成是目前生物科研和应用经常遇到的实验，一般委托专门的生物公司进行合成，目前应用最广的合成方法是通过设计多条overlap的引物通过退火扩增的方式，然后进行pcr扩增，获得全长的DNA。另外一中方案通过芯片的技术进行高通量DNA合成，虽然可以大规模低成本的合成DNA，但是合成长度较短。对于长链复杂DNA的合成，以及长链DNA合成目前仍然是此领域的难题，需要耗费大量的精力和时间，合成周期没有保障，甚至合成失败。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术旨在提出了一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，该方法先用引物合成一级片段，再合成二级片段，最终组装成全长片段。一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，通过先用引物合成一级片段，再进行二级片段组装，最后组装成最终的DNA序列。具体步骤为：1)DNA片段拆分；a、二级片段拆分：二级片段长度限定小于等于<1200bp；对于大于1200bp的片段遵循计算公式：如果L/1200为整数则N2＝INT(L/1200)，否则N2＝INT(L/1200)+1；二级片段长度L2＝INT(L/N2)，第1到N2-1个二级片段长度为L2,第N2个二级片段长度为L-L2*(N2-1)；b、一级片段拆分：将二级片段进一步平均拆分成长度为100-200bp的一级片段；如果L2/200为整数则N1＝INT(L2/200)，否则N1＝INT(L2/200)+1；一级片段长度L1＝INT(L2/N1)，第1到N1-1个一级片段长度为L1，第N1个一级片段长度为L2-L1*(N1-1)；其中L为待合成DNA片段长度；L1为一级片段长度；L2为二级片段长度；N1为每个二级片段拆分成一级片段数量；N2为合成片段拆分成二级片段的数量，函数INT()取一个数的整数部位值。2)一级片段合成：一级片段合成是通过相互over lap的引物退火合成的，每条引物长度不超过59bp，根据每个一级片段的长度拆分成3-5条引物进行合成，因为一级片段比较短小，一般不超过200bp所以能够耐受高GC含量，并且有效拆分DNA复杂性，化繁为简；3)一级片段组装：一级片段末端设有TypeIIS酶切位点，酶切后产生的粘性末端与相邻的一级片段粘性末端互补，最两端的一级片段黏末端与BIOWALK载体系统供给载体产生的粘末端互补以便克隆到BIOWALK载体系统，进行二级片段的组装；一级片段组装通过typeIIS限制性内切酶，酶切连接技术将5-6个一级片段无缝的装载到BIOWALK供给载体；4)二级片段组装：二级片段组装采用BIOWALK技术的原理，采用逐个添加的方式，稳定的将二级片段一个个的克隆到接受载体完成最终片段的拼装。优选地，二级片段组装采用先将二级片段交替装载到A类供给载体和B类供给载体上，然后轮流组装到接受载体上实现大片段的合成。本专利技术产生的有益效果为：本专利技术一级片段组装式以无缝的形式进行酶切连接组装，所以完全不受DNA的复杂性和GC含量的影响，合成质量稳定；一级片段长度控制在100-200bp范围，因为一级片段较为短小所以最大程度的克服复杂片段DNA合成和高GC含量的DNA合成的困难，能够合成超长的DNA片 段，稳定合成30kb以内的DNA片段，满足了现代分子实验的需求。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例：一个10221bp的DNA合成第一步，将整个片段拆分成二级片段根据总序列的长度DNA片段将被拆分成9段，每段约1136bp。SegB1：1-tagaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg-6061-ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg-120121-gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga-180181-caacttaata acacattgcg gacgttttta atgttagact gaattaacgc cgaattaatt-240241-cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaatt ttattgatag-300301-aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaac acatgagcga-360361-aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattat tatggagaaa-420421-ctcgagcttg tcgatcgaca gatccggtcg gcatctactc tatttctttg ccctcggacg-480481-agtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc gagtacttct acacagccat cggtccagac-540541-ggccgcgctt ctgcgggcga tttgtgtacg cccgacagtc ccggctccgg atcggacgat-600601-tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaa ttgccgtcaa ccaagctctg-660661-atagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agtcgtggcg atcctgcaag-720721-ctccggatgc ctccgctcga agtagcgcgt ctgctgctcc atacaagcca accacggcct-780781-ccagaagaag atgttggcga cctcgtattg ggaatccccg aacatcgcct cgctccagtc-840841-aatgaccgct gttatgcggc cattgtccgt caggacattg ttggagccga aatccgcgtg-900901-cacgaggtgc cggacttcgg ggcagtcctc ggcccaaagc atcagctcat cgagagcctg-960961-cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc cagtgataca catggggatc-10201021-agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt agtgtattga ccgattcctt gcggtccgaa-10801081-tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg atcgcatcca tagcctSegB2：ccgc-114011本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，其特征在于，通过先用引物合成一级片段，再进行二级片段组装，最后组装成最终的DNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，其特征在于，通过先用引物合成一级片段，再进行二级片段组装，最后组装成最终的DNA序列。2.如权利要求1所述的一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，其特征在于，具体步骤为：1)DNA片段拆分；a、二级片段拆分：二级片段长度限定小于等于<1200bp；对于大于1200bp的片段遵循计算公式：如果L/1200为整数则N2＝INT(L/1200)，否则N2＝INT(L/1200)+1；二级片段长度L2＝INT(L/N2)，第1到N2-1个二级片段长度为L2,第N2个二级片段长度为L-L2*(N2-1)；b、一级片段拆分：将二级片段进一步平均拆分成长度为100-200bp的一级片段；如果L2/200为整数则N1＝INT(L2/200)，否则N1＝INT(L2/200)+1；一级片段长度L1＝INT(L2/N1)，第1到N1-1个一级片段长度为L1，第N1个一级片段长度为L2-L1*(N1-1)；其中L为待合成DNA片段长度；L1为一级片段长度；L2为二级片段长度；N1为每个二级片段拆分成一级片段数量；N2为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳，
申请(专利权)人：武汉伯远生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42