一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用，方法包括如下步骤：S1、提取转基因阳性样本全基因组，然后加入Tn5转座酶进行打断建库，得到第一混合物；S2、采用带有barcode序列的引物，经PCR扩增所述第一混合物，得到带有不同barcode序列的第二混合物；S3、纯化所述带有不同barcode序列的第二混合物，然后将纯化后的第二混合物均一混合后，进行高通量测序；S4、对高通量测序数据进行数据分析，鉴定获得转基因元件的插入位点信息；本方法建库流程简单：采用Tn5转座酶建库，流程简单快速；成本低廉：可以进行多样品混测，并且是利用PCR扩增反应靶向富集目标序列侧翼序列，对于测序量要求不高，1G测序量的成本能满足分析几十个样品的分析需求。满足分析几十个样品的分析需求。满足分析几十个样品的分析需求。

【技术实现步骤摘要】
一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用


[0001]本专利技术属于转基因
，具体涉及一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用。

技术介绍

[0002]在动植物基因功能研究和分子育种中，为了研究基因的功能，人们经常会利用转基因或基因编辑技术，对动植物体内的目标基因进行改造和定向编辑。然而，利用这些转基因技术，必然会将外源片段插入到宿主的基因组内，同时鉴定这些转基因元件的具体情况和信息，对于基因功能研究和分子育种的应用影响很大。
[0003]目前出现很多不同的方法鉴定转基因元件的插入位点，如反向PCR技术，其是利用限制性内切酶酶切含有已知标签序列的DNA，使DNA片段含有特异的粘性末端，再通过DNA连接酶使酶切后的DNA片段连接成环，之后，根据已知标签序列设计一对反向引物，对环状DNA进行PCR扩增，最终得到的产物即为含有标签序列侧翼的未知序列，但是该技术存在DNA酶切后环化效率不高、有些物种没有合适内切酶使用等问题。另外一种鉴定方法为热不对称交错PCR(Tail
‑
PCR)技术，该技术涉及3套特异性引物和一个具有低退火温度的低特异性的简并引物进行组合，通过三轮热不对称的PCR反应，来大量富集所需要的片段，随后对PCR产物进行Sanger测序，从而获得已知标签序列的侧翼序列，但该方法存在PCR扩增繁琐、非特异性产物较多等诸多问题。近年来，基于高通量测序的全基因组重测序发展越来越迅速，该方法通过进行全基因比对，即可获得目标序列的侧翼序列、拷贝数等信息，并且该方法简单高效，但是需要全基因测序，成本较高，难以大规模的使用。
[0004]有鉴于此，有必要开发一种可以高效低成本的实验方法和分析流程，可以快速的鉴定多样品的转基因元件插入位点情况。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法及其应用。本专利技术基于高通量测序技术能快速鉴定转基因元件的插入位点，从而可以实现高效低成本的对多个样品的转基因元件的插入位点和拷贝数进行鉴定分析。
[0006]本专利技术的一个目的在于提供一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法。
[0007]一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法，包括如下步骤：
[0008]S1、提取转基因阳性样本全基因组，然后加入Tn5转座酶进行打断建库，得到第一混合物；
[0009]S2、采用带有barcode序列的引物，经PCR扩增所述第一混合物，得到带有不同barcode序列的第二混合物；
[0010]S3、纯化所述带有不同barcode序列的第二混合物，然后将纯化后的第二混合物均一混合后，进行高通量测序；
[0011]S4、对高通量测序数据进行数据分析，鉴定获得转基因元件的插入位点信息。
[0012]进一步地，步骤S1中，在所述Tn5转座酶打断建库的过程中，添加接头序列，使打断后的基因组的两侧分别加上接头。
[0013]该步骤中，利用Tn5转座酶在打断建库的过程中，可以对基因组边打断边加入接头的特点，使打断后的基因组的两侧分别加上接头，为后续PCR建库提供条件。
[0014]进一步地，所述接头序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0015]进一步地，步骤S2具体包括如下步骤：
[0016]S21、根据打断后的基因组的两侧的接头序列，设计带有barcode序列的AD1引物；
[0017]S22、根据转基因阳性样本中的转基因序列，设计2个特异性引物；
[0018]S23、以AD1引物序列分别与2个特异性引物进行两轮PCR扩增反应，即可得到带有不同barcode序列的第二混合物。
[0019]进一步地，步骤S21中，所述AD1引物序列如SEQ ID NO.3所示。
[0020]具体为：5
’‑
nnnnnnnGTNNNNNNTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTA
‑3’
[0021]其中，N代表任意碱基，为barcode序列；n为barcode的成环互补序列，引入成环序列，避免barcode序列与接头序列形成二聚体，也可以有效的避免接头引物在基因组其他位置进行非特异性扩增；GT碱基为间隔序列，便于后续barocde序列的定位和多样品混合拆分。
[0022]进一步地，步骤S22中，所述2个特异性引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，并且所述2个特异性引物在转基因序列中的相对距离为100～200bp。
[0023]该步骤中，所述2个特异性引物在转基因序列中的相对距离设为100～200bp，可以达到更好的区分效果。
[0024]步骤S23中，以AD1引物序列分别与2个特异性引物进行两轮PCR扩增反应，可以靶向富集所需要的转基因元件的侧翼序列。
[0025]进一步地，步骤S3中，所述高通量测序选用PCR
‑
free建库和PE150测序模式。
[0026]进一步地，步骤S4具体包括如下步骤：
[0027]S41、将通过高通量测序获得的reads序列与目标转基因元件序列进行blastn比对，提取出具有相似性的序列；
[0028]S42、根据比对情况，从所述具有相似性的序列中提取出只有部分比对到载体序列的reads序列；
[0029]S43、提取只有部分比对到载体序列的reads序列，进行全基因比对分析，即可鉴定获得转基因元件的插入位点信息和/或拷贝数信息。
[0030]该步骤的分析方法能够更快更节省计算内存，快速给出分析结果。
[0031]本专利技术的另一个目的在于提供一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法在快速鉴定转基因元件插入基因组位点中的应用。
[0032]进一步地，所述基因组为动物基因组、植物基因组和微生物基因组中的一种。
[0033]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0034]1)建库流程简单：采用Tn5转座酶建库，流程简单快速；
[0035]2)成本低廉：可以进行多样品混测，并且是利用PCR扩增反应靶向富集目标序列侧翼序列，对于测序量要求不高，1G测序量的成本既可以满足分析几十个样品的分析需求；
[0036]3)生信分析流程简单高效：采用先与目标已知序列进行比对，而不是先进行全基
因组比对，可以极大的节省运行内存，快速给出分析结果。
附图说明
[0037]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0038]图1为本专利技术高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法流程图。
具体实施方式
[0039]下面将结合本专利技术实施例中的附图对本专利技术实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、提取转基因阳性样本全基因组，然后加入Tn5转座酶进行打断建库，得到第一混合物；S2、采用带有barcode序列的引物，经PCR扩增所述第一混合物，得到带有不同barcode序列的第二混合物；S3、纯化所述带有不同barcode序列的第二混合物，然后将纯化后的第二混合物均一混合后，进行高通量测序；S4、对高通量测序数据进行数据分析，鉴定获得转基因元件的插入位点信息。2.如权利要求1所述的高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法，其特征在于，步骤S1中，在所述Tn5转座酶打断建库的过程中，添加接头序列，使打断后的基因组的两侧分别加上接头。3.如权利要求2所述的高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法，其特征在于，所述接头序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求2所述的高效低成本鉴定转基因元件插入位点的方法，其特征在于，步骤S2具体包括如下步骤：S21、根据打断后的基因组的两侧的接头序列，设计带有barcode序列的AD1引物；S22、根据转基因阳性样本中的转基因序列，设计2个特异性引物；S23、以AD1引物序列分别与2个特异性引物进行两轮PCR扩增反应，即可得到带有不同barcode序列的第二混合物。5.如权利要求4所述的高效低成本鉴定转...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳，吴磊，
申请(专利权)人：武汉伯远生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：