本发明专利技术涉及一种操作简单、特异性高、特异性扩增效率超过2n倍的DNA体外扩增技术，即巢式共扩增聚合酶链式反应试剂盒，其英文名称是nest?coamplific?ation?polymerase?chain?reaction，英文缩写是NCA-PCR；首先根据待扩增靶DNA序列合成一对特异的外侧引物和一对特殊的巢式引物，然后将内侧与外侧引物放入同一个含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、聚合酶链式反应缓冲液、超纯水等组成的扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环，使内外侧引物同时引导新链合成，获得分别由内内、外外、内外侧引物界定的聚合酶链式反应产物，由于每一循环中合成的由外外、内外侧引物界定的聚合酶链式反应产物都可以作为内内引物附加的模板，使内内引物引导的聚合酶链式反应产物以每个热循环超过2倍的速度增加，经过n个循环，内内引物引导的聚合酶链式反应产物理论值即扩增为初始模板量的1/4(n2+3n)2n倍，大大提高了特异性扩增的效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种聚合酶链式反应试剂盒，具体是涉及一种，比常规聚合酶链式反 应试剂盒技术更高特异性、更高扩增效率的巢式共扩增聚合酶链式反应试剂盒，属于分子 生物学检测技术中的DNA体外扩增
技术介绍
在现有的DNA体外扩增技术中，聚合酶链式反应是最主要的也是很有效的常用技 术，在常规聚合酶链式反应试剂盒中，由于经常遇到引物二聚体和其它非特异性扩增的产 生，而一旦产生非特异性模板，由于其与特异性扩增的效率相当，并竟争底物与酶，往往与 特异性扩增差不多同时进入扩增的平台期，这不仅使扩增结果难以判断，而且使特异性扩 增效率降低，尤其在扩增粗提的临床标本时，常导致临床基因诊断的假阳性和假阴性结果 的产生。用于提高聚合酶链式反应试剂盒扩增特异性的方法，已有热启动法、固体石蜡膜 法、抗体-酶法、双链引物法，这些方法虽然都能在一定程度上提高聚合酶链式反应试剂盒 扩增的特异性与其扩增效率，但与常规聚合酶链式反应试剂盒相比都只是略有改进，而没 有本质的变化，特异性扩增效率都不会超过2n倍。巢式聚合酶链式反应试剂盒是一种特异性很高的聚合酶链式反应试剂盒，其本质 是在一段待扩增的靶序列中设计外侧、内侧两对引物，先用外侧引物进行扩增，完成后再取 扩增产物作模板用内侧引物扩增，即要进行两次连续的聚合酶链式反应，这种方法操作较 复杂，费时较长，而其每一次的聚合酶链式反应试剂盒中，扩增的效率也不会超过2n倍，同 时由于第二次扩增要用外侧引物扩增的聚合酶链式反应试剂盒产物做模板，很容易造成聚 合酶链式反应试剂盒产物污染，导致扩增的假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种操作简单，特异性扩增效率超过2n倍的、高特异性的 DNA体外扩增技术，即巢式共扩增聚合酶链式反应试剂盒，其英文名称是nest coamplific ationpolymerase chain reaction, 英文缩写是NCA-PCR。本专利技术的技术方案是首先根据待扩增靶DNA序列合成一对特异的外侧引物和一对特殊的巢式引物，然 后将内侧与外侧引物放入同一个含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、聚合酶链 式反应缓冲液、超纯水等组成的聚合酶链式反应扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行 高温、低温、中温的反复热循环，使内外侧引物同时引导新链合成，获得分别由内内、外外、 内外侧引物界定的聚合酶链式反应产物；由于每一循环中合成的由外外、内外侧引物界定 的聚合酶链式反应产物都可以作为内内引物附加的模板，使内内引物引导的聚合酶链式反 应产物以超过2倍的速度增加，经过η个循环，其理论值为初始模板量的1/4 (η2+3η) 2η倍， 大大提高了特异性扩增的效率。所用扩增缓冲反应体系是由引物、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、聚 合酶链式反应缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的终浓度分别如下特异的引物每条 0. 2-0. 4umol/L、Taq DNA 聚合酶 l_3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5mmol/L、模板 DNA 若干、 Mg++1. 5-3. 5mmol/L、缓冲液 1-1. 5XPCR ；其中 IXPCR 缓冲液包括 50mmol/L KClUOmmol/ LTris, HCl ΡΗ8· 3、0· 01 % 明胶。该巢式共扩增聚合酶链式反应由于每一循环中合成的由外外、内外侧引物界定的 聚合酶链式反应产物都可以作为内内引物附加的模板，使内内引物引导的聚合酶链式反应 产物以超过2倍的速度增加，经过η个循环，其理论值为初始模板量的1/4 (η2+3η) 2η倍，与 常规巢式聚合酶链式反应方法相比，具有以下优点1、操作简便快速，只做一次聚合酶链式 反应即可达到巢式扩增的提高特异性的效果；2、扩增前不进行聚合酶链式反应产物操作， 减少可能出现的聚合酶链式反应产物污染；3、自动化程度高，人工成本低，还可以高通量检 测，每次可以检测90个以上标本；4、需要的检测样本材料微量，每个反应最低仅需要待检 靶DNA 10拷贝，便于取材。根据上述巢式共扩增聚合酶链式反应原理，将上述引物和其他聚合酶链式反应试 剂混合后分装到聚合酶链式反应扩增管中，并配以系列稀释度的标准DNA模板组装成巢式 共扩增聚合酶链式反应试剂盒。有鉴于此，我们设计了一种操作简单、特异性高、特异性扩增效率超过2η倍的DNA 体外扩增技术即巢式共扩增聚合酶链式反应试剂盒。附图说明 附图是本专利技术的原理示意图具体实施例方式下面结合附图和实例对本专利技术做进一步的描述实施例1、材料用本室常规的盐析法提取30份正常人外周血DNA，作为待扩增模板。引物设计根据脆性X智力低下1号基因(fragile X mental retardation 1， FMRl)的 5，非翻译区序列(GenBanK S74494 和 Nature Genet，8 (1) 88-94，1994)合成以下 特异的内外侧引物外侧上游引物Pl :5，-GGT TTC ACC TTC CGG TGG AGG-3，(SEQ ID NO 1)；外侧下游引物P2 :5，-CTC CAT CTT CTC TTC AGC CCT GC-3，(SEQ ID NO :2)；内侧上游引物 P3 :5，-AAA CCC CTG CAG GGG CGT GCG GCA GCG-3，(SEQ ID NO 3)；内侧下游引物P4 5'-AAA CGT CGG GCC CGA CGC CCG CGA GCT C_3，(SEQ ID NO 4)。2、巢式共扩增聚合酶链式反应试剂盒的反应巢式共扩增聚合酶链式反应混合50ul反应体系，内含内、外侧引物(PI、P2、P3、 P4)各 10pmol，正常人 DNA 5-10ng, 1X PCR 缓冲液，Taq DNA 聚合酶 2u，Mg++终浓度 2mmol/L,然后在PE9600上96°C下变性5分钟，然后按96°C 20秒，65°C 40秒，72°C 1分30秒热循 环28次；同时用仅有相同浓度的内侧引物P3、P4，其它成分和反应条件完全相同的常规聚 合酶链式反应做对照实验。3、2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，GelDoclOOO下观察，灰度扫描分析记录各聚 合酶链式反应的结果，并比较各个标本巢式共扩增聚合酶链式反应和相应常规聚合酶链式 反应的P3P4片段扩增强度。4、结果在30个标本的巢式共扩增聚合酶链式反应和对应的常规聚合酶链式反应中，都 获得了预期大小的P3P4DNA条带，未加DNA标本的阴性对照未见相应扩增产物，经统计学分 析巢式共扩增聚合酶链式反应产生的P3P4DNA片段的量，显著大于常规聚合酶链式反应产 生的P3P4DNA片段的量。巢式共扩增聚合酶链式反应过程中，96°C时，模板DNA变性为单链；65°C时引物 P1、P2、P3、P4分别与DNA相应靶位点结合，并分别引导合成新链；当Pl引导合成的新链到 达P3引导合成的新链时，随着该新链的继续延伸，P3引导合成的新链逐步从模板上解链为 单链，从而P3、P4又分别与该新合成的单链上相应结合位点结合引导相应的DNA新链合成； 这样，第一个循环结束时，一分子的P1P2模板将产生二分子的P1P2，一分子的P1P4，一分子 的P3本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种操作简单、特异性高、每个循环特异性扩增效率可以超过２倍的ＤＮＡ体外扩增技术，即巢式共扩增聚合酶链式反应试剂盒，其英文名称是ｎｅｓｔ ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，英文缩写是ＮＣＡ－ＰＣＲ；首先根据待扩增靶ＤＮＡ序列合成一对特异的外侧引物和一对特殊的巢式引物，然后将内侧与外侧引物放入同一个含有耐热ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、模板ＤＮＡ、镁离子、聚合酶链式反应缓冲液、超纯水等组成的扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环，使内外侧引物同时引导新链合成，获得分别由内内、外外、内外侧引物界定的聚合酶链式反应产物；其特征在于每一循环中合成的由外外、内外侧引物界定的聚合酶链式反应产物，都可以作为内内引物扩增附加的模板，使内内引物引导的聚合酶链式反应产物以每个热循环超过２倍的速度增加，经过ｎ个循环，内内引物引导的聚合酶链式反应产物理论值即扩增为初始模板量的１／４（ｎ２＋３ｎ）２ｎ倍。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏庆杰，刘钦松，
申请(专利权)人：山东博奥克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：37
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