利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的方法、组合物和试剂盒技术

本发明专利技术提供一种利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的方法、组合物和试剂盒。本发明专利技术能够通过结合转座子酶和单向特异性扩增及高通量测序的方法，完成了目标区域扩增的过程，并且很好的还原了原始的DNA突变频率。可实现对特定DNA序列的检测，达到对肿瘤细胞突变或者遗传病的基因进行检测的目的。本发明专利技术克服了传统的方法需要杂交或者在大量PCR扩增中存在的偏向性的问题，同时保留了突变频率，并克服了测序错误和扩增错误带来的样本的假阳性问题。

Method, compositions and kits for in vitro nucleic acid amplification by using an enzyme of the transposon

The invention provides a method, a composition and a kit for carrying out in vitro nucleic acid amplification by using an enzyme of the transposon. The invention can complete the process of target region amplification through the combination of the method of combining with the specific amplification of the transposon and the high throughput sequencing, and can well restore the original DNA mutation frequency. The utility model can realize the detection of the specific DNA sequence, and can achieve the purpose of detecting the gene mutation of the tumor cell or the genetic disease. The invention overcomes the shortcomings of traditional methods need hybridization or bias problems in a large number of PCR amplification, while retaining the mutation frequency, and overcomes the error and the error caused by the sequencing of amplified samples of false positives.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体地涉及利用转座子酶进行核酸分子单向扩增的方法、组合物和试剂盒。
技术介绍
人的基因组有三十亿个碱基对，选取其中的部分碱基如致病的部分进行分析，是目前临床的主要需求，而如何在全基因组范围内对特定的序列进行捕获，是一个世界性的难题。转座子酶，是一种执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点，无同源性要求。目前已经有对转座子酶进行改造，以达到让转座子酶插入特定序列的技术(例如来自Epicentre的NEXTERATM体系)。利用此类技术可以实现基因组DNA的片段化，但是该技术仍然不能在全基因组范围内对特定的序列进行捕获。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的一方面，提供一种利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的方法，其包括以下步骤：提供转座子酶和核酸的步骤；提供第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列的步骤；使所述转座子酶与所述核酸进行反应，从而改变所述核酸的序列的步骤；利用所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列进行核酸扩增的步骤；其中所述转座子酶包含至少一种转座子酶结合序列，所述第一寡核苷酸序列的至少一部分与所述核酸中的特定区域结合，所述第二寡核苷酸序列包含转座子酶结合序列中的至少一部分。本专利技术的另一方面，提供一种利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的组合物和试剂盒，其分别包含转座子酶、第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列；其中所述转座子酶包含至少一种转座子酶结合序列，所述第一寡核苷酸序列的至少一部分与所述核酸中的特定区域结合，所述第二寡核苷酸序列包含转座子酶结合序列中的至少一部分。在优选的实施方案中，本专利技术的组合物和试剂盒可进一步包含核酸，例如，全基因组DNA或其片段。在优选的实施方案中，所述第一寡核苷酸序列包含5'端引物，且所述第二寡核苷酸序列包含3'引物。在另一优选的实施方案中，所述第一寡核苷酸序列包含3'端引物，且所述第二寡核苷酸序列包含5'端引物。在另外优选的实施方案中，所述第一寡核苷酸序列和/或所述第二寡核苷酸序列进一步包含索引序列和/或标记序列。在另外优选的实施方案中，所述转座子酶包含第一转座子酶结合序列和第二转座子酶结合序列。在优选的实施方案中，所述核酸中的特定区域位于开放阅读框(例如，EGFR开放阅读框)内。本专利技术通过利用转座子酶向核酸，特别是基因组DNA分子中加入特定序列，并通过统一引物定向扩增和特异性引物扩增，实现对核酸，例如DNA中特异位点的扩增。进一步通过例如高通量测序的方法，最终实现对特异位点基因型的识别，并定性定量的分析扩增的位点。本专利技术通过结合转座子酶和单向特异性扩增和高通量测序的方法，完成了目标区域扩增的过程，并且很好的还原了原始的DNA突变频率。可实现对特定DNA序列的检测，达到对基因，特别是肿瘤细胞突变或者遗传病的基因进行检测的目的。本专利技术克服了传统的方法需要杂交或者在大量PCR扩增中存在的偏向性的问题，同时保留了突变频率，并克服了测序错误和扩增错误带来的样本的假阳性问题。附图说明图1为示例性示出本专利技术中的转座子酶结构的图。其中，1为具有转座子酶活性的蛋白质；2为第一转座子酶结合序列；3为第一引物序列；4为第二转座子酶结合序列；5为第二引物序列。图2为示例性示出本专利技术所述扩增方法的图。图2中，6、9分别为索引序列(index序列)，其中，6和9表示的index序列可相同或不同；7为P5序列(例如，SEQ ID NO:4)；8为3’端引物；10为P7序列(例如，SEQ ID NO:5)。需要说明的是，在本专利技术中相同的附图标记表示相同或相似的含义。例如，图1和图2中的附图标记2均表示第一转座子酶结合序列。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料(例如，组合物或试剂盒)，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。本专利技术中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。例如，“转座酶”包括此类转座酶的复数，“样品”包括一种或多种样品和为本领域技术人员所已知的其等同物等等。本专利技术中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。本专利技术中，术语“核酸”是指任何类型的DNA分子，优选基因组DNA，其长度通常在数千到数百万碱基之间。本专利技术中，“核酸”还包含基因组DNA片段的含义。本专利技术中，术语“转座子酶”，有时也称作“转座酶”，是一种执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点，无同源性要求。本专利技术中所述转座子酶包括天然存在的转座酶或重组转座酶。优选地，转座酶至少某种程度上从其天然环境(即，细胞核或细胞浆)中分离或纯化。对于重组产生的转座酶，优选地，重组转座酶至少某种程度上从重组宿主环境(即，细胞核或细胞浆)中分离或纯化。最优选地，转座酶被纯化至90％以上，例如，约95％以上、约98％以上或99％以上。优选地，转座酶不仅包含本申请日之前已鉴定的任何转座酶，还包含基于目前已知的基因组学知识能够确定可能具有转座酶活性，并在本申请日之后鉴定其活性的转座酶。优选地，本专利技术中使用对天然转座子酶进行改造，以达到让转座子酶插入特定序列的酶。在示例性实施方式中，本专利技术所述的转座酶是转座酶的IS4家族的成员，例如在Vibrio种中天然发现的一种，包括但不限于Vibrio harveyi。在示例性实施方式中，本专利技术使用包括一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的工程改造的转座酶。应当理解，尽管修饰可能在某些方面改变特异性或活性，但对天然存在的转座酶所做的这些修饰不会消除酶的转座酶活性。在示例性实施方式中，本专利技术可使用商购的转座酶，例如，来自Epicentre的NEXTERATM体系中的转座酶；或者可使用目前已知文献中公开的转座酶，例如CN102796728A中所述的转座酶。优选地，本专利技术使用经修饰的Tn5转座酶。在示例性实施方式中，所述转座子酶可为具有转座子酶活性的蛋白质本身。在另外的实施方式中，所述转座子酶为包含具有转座子酶活性的蛋白质以及转座子酶结合序列的组合体。在转座子酶组合体的情况下，可通过转座子酶结合序列而在核酸中或其片段上加入任意所需的序列。本专利技术中，术语“转座子酶结合序列”是指与特定转座酶结合的识别序列。每一种转座酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的方法，其包括以下步骤：提供转座子酶和核酸的步骤；提供第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列的步骤；使所述转座子酶与所述核酸进行反应，从而改变所述核酸的序列的步骤；利用所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列进行核酸扩增的步骤；其中所述转座子酶包含至少一种转座子酶结合序列，且所述第一寡核苷酸序列的至少一部分与所述核酸中的特定区域结合，所述第二寡核苷酸序列包含转座子酶结合序列中的至少一部分。

【技术特征摘要】
1.一种利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的方法，其包括以下步骤：提供转座子酶和核酸的步骤；提供第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列的步骤；使所述转座子酶与所述核酸进行反应，从而改变所述核酸的序列的步骤；利用所述第一寡核苷酸序列和所述第二寡核苷酸序列进行核酸扩增的步骤；其中所述转座子酶包含至少一种转座子酶结合序列，且所述第一寡核苷酸序列的至少一部分与所述核酸中的特定区域结合，所述第二寡核苷酸序列包含转座子酶结合序列中的至少一部分。2.一种利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的组合物和试剂盒，其包含转座子酶、第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列；其中所述转座子酶包含至少一种转座子酶结合序列，且所述第一寡核苷酸序列的至少一部分与所述核酸中的特定区域结合，所述第二寡核苷酸序列包含转座子酶结合序列中的至少一部分。3.根据权利要求1所述的方法或权利要求2所述的组合物和试剂盒，其中所述第一寡核苷酸序列包含5'端引物，且所述第二寡核苷酸序列包含3'引物。4.根据权利要求1所述的方法或权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：田埂，
申请(专利权)人：元码基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11