本发明专利技术涉及生物科学技术领域，由于红花的两种有效成分羟基红花黄色素A(HSYA)和4-{11’-羟基-11’-巯基-11’-{1’-[2’-(N→O)-异喹啉基]}-1-苯甲酸(IQBA)含量的高低，直接影响红花品质。本发明专利技术采用cDNA-AFLP对两者的表达特性进行分析，分离与两种有效成分HSYA和IQBA密切相关的差异表达基因，通过RT-PCR进一步验证其特征基因型及cDNA-AFLP方法的正确性。本发明专利技术获得的特异性DNA片段具有SEQ?ID?NO：1-3所示的核苷酸序列。本发明专利技术将上述特异性DNA片段用于筛选含两种有效成分HSYA和IQBA的红花品种，进而为实现红花高品质性状的定向调控提供良好条件。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物科学
，具体涉及一种含两种有效成分羟基红花黄色素A 和4- {11，-羟基-11，-巯基-11，- {1，- } 苯甲酸的红花的筛选方法。
技术介绍
红花Carthmus tinctorius L.为菊科植物红花的干燥管状花，临床应用广泛。主要化学成分有黄酮类、吲哚类、木脂素类、烷基二醇类等。其中羟基红花黄色素 A(Hydroxysafflor yellow A，简称HSYA)是红花的重要活性成分，具有抗心肌缺血、脑缺血、抑制血小板聚集、抗氧化等多种药理作用，对心脑血管疾病有很好的防治作用，具有很好的应用前景(吴伟，李金荣，朴永哲，董宁宁，金鸣.羟基红花黄色素A缓解大鼠心肌线粒体损伤的作用研究.中国药学杂志，2006,41(16) :1225-1227 ；金鸣，高子淳，王继峰.羟基红花黄色素A抑制PAF诱发的家兔血小板活化的研究.北京中医药大学学报，2004，27 (5) 32;金呜，李金荣，吴伟.羟基红花黄色素A抗氧化作用的研究.中草药，2004，35 (6) :665; 施峰，刘焱文，红花的化学成分及药理研究进展，时珍国医国药。2006，17 (9) :1666-1667)。 4-{11，-羟基-11，-巯基-11，-{1，-}-1-苯甲酸(简称 IQBA) 是本专利技术人从中药红花中研究获得的又一个具有脑缺血保护作用的化合物(Ge Zhang, Mei-Li Guo, Run-Ping Li, Ying Li, Han-Ming Zhang, Zhong-Wu Su.A NOVEL COMPOUND FROM FlosCarthami AND ITS BI0ACTIVITY. Chemistry of Natural Compounds. 2009,45 339-341)。因此，红花中HSYA和IQBA含量的高低，直接影响红花品质的优劣。对红花品质相关功能基因进行研究，对提高红花的产量和质量具有重要意义。前期研究工作，本专利技术人应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含羟基红花黄色素A的红花进行差异表达分析，专利技术了一种筛选含羟基红花黄色素A的红花品种的方法已获得中国专利(中国专利ZL 200810037322. 8，专利技术创造名称一种含羟基红花黄色素A 的红花的筛选方法)。在此基础上，为了更有效地筛选含有效成分种类多的红花，本专利技术人继续进行研究，专利技术了另一种筛选含两种有效成分HSYA和IQBA的红花的新方法。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种含两种有效成分HSYA和IQBA的红花的筛选方法。本专利技术应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含HSYA和IQBA的红花进行差异表达分析，在红花中找到与HSYA和IQBA紧密连锁的3条基因，该基因具有如SEQ ID N0. 1-3 所示的核苷酸序列。具体方法如下本专利技术以含HSYA和IQBA的红花品系No. 16为母本，不含HSYA和IQBA的红花 No. 25为父本进行杂交，获得Fl代种子，Fl代种子进行自交加代获得的F2种子，继续种植， 从单粒F2种子获得F2代群体共计215个单株。然后进行以下步骤1.根据F2代群体的HSYA和IQBA的含量有无，取等量含HSYA和IQBA的F2代个体的花冠混成有池，另取不含HSYA和IQBA的F2代个体的花冠混成无池；2.提取红花总RNA，反转录成双链cDNA ；3.通过cDNA-AFLP对含有HSYA和IQBA与不含HSYA和IQBA的红花的差异表达分析，在Msel-AG/I^stl-AT的引物组合中获得TDF_2、TDF_3两条片段，在Msel-AC/I^stl-AT 引物组合中获得TDF-9' —条片段；4.对3条片段进行回收，克隆和测序。TDF-2具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；TDF-3具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；TDF-9'具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种含HSYA和IQBA的红花的筛选方法，该方法是用cDNA序列分析方法鉴定红花基因中含有如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的两个核苷酸序列，或SEQ ID No. 3所示的一个核苷酸序列。上述序列分析方法包括RT-PCR方法、Northerning Bloting法以及cDNA末端快速扩增(RACE)法等。上述方法包括以下步骤A、根据 TDF-2(SEQ ID No. 1)，TDF-3 (SEQ ID No. 2), TDF-9' (SEQID No. 3)序列设计并合成RT-PCR引物，TDF-2 引物S2 5，-GATTACGTGATTGCAAACGAACAAC-3，A2 5' -GTTGTTCGTTTGCA ATCACGTAATC-3‘TDF-3 引物S3 5，-GGCCTATTTGCCCTCCCTGCATTCG-3，A3 5' -CGAATGCAGGGAGGGCAAATAGGCC-3‘TDF-9 ‘引物A9 :5，-CAGAAACTCTAAAAAATGTTTGCAA-3，S9 :5， -TTGCAAACATTTTTTAGAGTTTCTG-3，S27 :5， -TTGGAGGATAAAGAGGAGGATCAGG-3，B、提取红花的总RNA ；C、以红花总RNA为模板，翻转录成第一链cDNA ；D、以第一链cDNA为模板加入合成的引物，进行PCR扩增；E、琼脂糖电泳，紫外显色；F、测序。在含HSYA和IQBA的红花中得到与SEQ ID NO. 1-3相同序列基因，而在不含HSYA 和IQBA的红花中未得到，证明cDNA-AFLP实验的可靠性。按照上述筛选含HSYA和IQBA的红花的方法，在含HSYA和IQBA的红花品种和不含HSYA和IQBA的红花品种共18个不同红花品种之间应用此方法，均发现在含有HSYA和 IQBA的红花中有与TDF-2，TDF-3，TDF-9'相同基因片段，而在不含HSYA和IQBA的红花中不存在。本专利技术为筛选含HSYA和IQBA的红花品种，进而为实现红花高品质性状的定向调控奠定基础。附图说明图1 红花cDNA-AFLP差异表达的银染结果。4其中箭头分别代表TDF-2，TDF-3 ；7-24 含HSYA和IQBA的F2代单株；1-6 不含 HSYA和IQBA的F2代单株图2 红花cDNA-AFLP差异表达的银染结果。其中箭头代表TDF-9' ；1-12 不含HSYA和IQBA的F2代单株；13-M 含HSYA和 IQBA的F2代单株图3 :cDNA-AFLP差异表达片段在RT-PCR的验证结果。其中1-7 含HSYA和IQBA的F2代单株；8-14 不含HSYA和IQBA的F2代单株。 具体实施例方式下面结合附图及实施例对本专利技术进行详细描述。实施例1 本专利技术TDF_2，3，9'片段的分离1.应用高效液相色谱方法、薄层色谱法及紫外分光光度法测定F2代群体的HSYA 和IQBA的含量，检测其有无。2.根据测定结果各取含与不含HSYA和IQBA的红花花冠，提取总RNA，并转化成双链 cDNA。3.构建含与不含HSYA和IQBA的近等基因池，取含HSYA和IQBA单株的cDNA各 1 μ g，共10株混成有池；另本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种含羟基红花黄色素Ａ和４－｛１１’－羟基－１１’－巯基－１１’－｛１’－［２’－（Ｎ→Ｏ）－异喹啉基］｝－１－苯甲酸的红花的筛选方法，，其特征在于该方法是用ｃＤＮＡ序列分析方法鉴定红花基因中含有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭美丽，杨娟，李东巧，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。