本发明专利技术公开了一种香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法与应用。该方法为用特异性引物对样本中含有的DNA进行PCR反应，当PCR产物呈现171bp条件，即样本中含有香蕉细菌性软腐病害病原菌。该方法操作简单，耗时少，通量大。通过该方法对香蕉种苗、种植区土壤浸提液、灌溉水等进行定性检测，得以实现我国香蕉无病种苗生产基地的建设、安全生产，同时堵截国外危险性带病香蕉传入的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农作物病害防治及植物检疫领域，具体涉及一种香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法与应用，即利用聚合酶链式反应(PCR)分子生物学技术对香蕉细菌性软腐病害病原菌进行高灵敏度快速检测，可用于香蕉种苗检疫、田间香蕉软腐病的早期诊断以及病菌的监测和鉴定。
技术介绍
香蕉细菌性软腐病病原菌为菊基腐病菌(PectcAacterium chrysanthemi)，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)欧文氏菌属(Erwinia)。该病原菌的致病性很强，可能为强致病亚种。这是我国新入侵危险病害，于2009年9月在广州番禺香蕉种植区首次发现，主要危害粉蕉、巴西蕉等。该病害为系统性维管束病害，首先内部叶片近叶柄处变脏黄色，叶柄崩溃，叶片萎蔫而死亡。感病假茎横切面维管束变绿黄色至红褐色，甚至黑色，尤其是里面叶鞘和果柄、假茎、根围及单个香蕉上均有暗色胶状物质及细菌菌溢。染病植株6 8天死亡，发病率达20 40%，严重地块可达90%以上，发病植株死亡率100%，且以较快的速度扩大感染面积。该病具有传播快，毁灭性强等特点，给香蕉生产造成巨大的经济损失。香蕉细菌性软腐病初期发病症状和香蕉枯萎病有些相似，故蕉农很难准确判断病原，传统的病原菌分离培养鉴定的方法又依赖于专业人员丰富的经验和系统的病原菌分类的理论知识，这样就会贻误最佳的防治时机。目前，防治香蕉细菌性软腐病还没有行之有效的方法。主要是以并定期检查蕉园，发现零星病株及时清除销毁，并撒施生石灰处理病土区，种植抗病耐病香蕉品种等综合防治措施。香蕉细菌性软腐病在温湿度适宜的条件下发病迅猛，健康植株一旦染病会很快死亡。因此，对香蕉细菌性软腐病应以预防为主，着重加强对该病害的检疫检测。为防止香蕉细菌性软腐病从疫区传入非疫区，确保国内香蕉的安全生产，建立一套稳定、简便、快速、灵敏的分子检测方法对香蕉种苗及种植区的土壤进行检疫检测是非常必要的。PCR检测方法具有灵敏度高、精度高、取样量微小、检测时间短等优点。通过该技术对香蕉种苗、种植区土壤浸提液、灌溉水等定性检测，为确保我国香蕉无病种苗生产基地的建设、安全生产，同时堵截国外危险性带病香蕉传入我国具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法。该方法操作简便易行，可以以试剂盒的形式直接应用于生产实践，用于带菌植物组织和土壤的高灵敏度快速检测，确保为生产提供健康无菌种苗、对病原菌分子预警具有十分重要的意义。本专利技术的另一目的在于提供所述香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法，包括以下步骤(1)设计PCR引物，其中上游引物LF 5，-TTCGTCTAGAGGCCCAGGAC-3，下游引物LR 5，-TCAGCTTGTTCCGGATTGTT-3，(2)对样本进行处理，得到样本中的DNA ；然后以样本的DNA为模板，进行PCR反应，电泳检测PCR产物，当PCR产物呈现171bp条带，即样本中含有香蕉细菌性软腐病害病原菌。步骤( 中所述的样本为香蕉植株组织时，所述处理的方式优选为利用CTAB法抽提香蕉植株组织中的DNA;步骤O)中所述的样本为土壤时，所述处理的方式优选为用无菌水浸泡土壤，得到的上清液为模板；更优选为每0. 5克土壤使用Iml无菌水浸泡半小时，得到的上清液为模板；步骤O)中所述的样本为病水时，所述处理的方式优选为用0. 22μπι的滤膜对病水进行过滤富集，制备更高浓度的病水直接作为模板；步骤⑵中所述PCR反应中的反应条件优选为94°C预变性5min ；94°C变性20s， 53°C退火20s，72°C延伸30s，35个循环；72°C总延伸IOmin ；所述香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法应用于香蕉种苗检疫、田间香蕉软腐病的早期诊断以及病菌的监测和鉴定。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果本专利技术根据香蕉细菌性软腐病病原菌的基因组序列，设计特异性引物。通过该技术对香蕉种苗、种植区土壤浸提液、灌溉水等定性检测，从而实现我国香蕉无病种苗生产基地的建设、安全生产，同时堵截国外危险性带病香蕉传入的目的。附图说明图1是本专利技术所述方法对不同参试菌株DNA扩增的结果示意图，其中泳道M为DNA Marker 2000 ；泳道1为香蕉细菌性软腐病菌；泳道2为梨火疫病病菌；泳道3为野油菜黄单胞病菌；泳道4为胡萝卜欧文氏菌；泳道5为香蕉细菌性枯萎病病菌；泳道6为玉米细菌性枯萎病病菌；泳道7为白叶枯病菌；泳道8为菜豆枯萎病菌病菌； 泳道9为丁香假单胞病菌；泳道ck-为阴性对照水。图2是本专利技术灵敏度的检测结果图，其中泳道M为DNA Marker 2000 ；泳道ck+为香蕉细菌性软腐病菌DNA ；泳道1 9分别为 IO9, IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2,10CFU/ml 的模板；泳道 ck-为阴性对照水。图3是本专利技术所述方法对不同样品的检测结果图，其中泳道M为DNA Marker 2000 ；泳道ck+为香蕉细菌性软腐病菌DNA ；泳道ck-为阴性对照水；泳道1 4为(表1中样品1、7、11、37)发病香蕉组织的DNA ；泳道5为人工接种病原菌的香蕉组织DNA;泳道6 8为(表1中样品4、8、14)发病地块病土样品；泳道9为人工接种病原菌病土(取50g田土于160°C的烘箱内干燥灭菌12h，待冷却后接种IO9CFU/ ml的香蕉细菌性软腐病菌悬液5ml，制备病土样品)样品；泳道10(表1中样品9)为病严重地块的病水样品；泳道11为健康香蕉组织的DNA。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1PCR技术检测香蕉细菌性软腐病的方法，其步骤是(1)细菌基因组DNA提取取冻存的香蕉细菌性软腐病病原菌三株(Firsti^port of a sort of banana in Mainland China Caused by a Dickeya sp. (Pectobacterium chrysanthemi). Plant Dis. 2010,94(5) :640-640.)分别接种到 NA 斜面培养基(牛肉膏 3g，酵母浸膏lg，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml)上在35°C环境中静置培养48h，挑取单菌落接种于液体NA培养基中，27 35°C，ISOrpm摇床培养过夜，用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)分别提取香蕉细菌性软腐病病原菌基因组DNA待用。(2)扩增香蕉细菌性软腐病16S-23S rDNA ITS序列用已经报道的细菌通用 ITS 弓丨物(primer 1 :5，-GAAGTCGTAACAAGG-3，；primer2 :5，-CAAGGCATCCACCGT-3，) 分别对三株香蕉细菌性软腐病病原菌基因组DNA进行扩增。反应体系为50μ1 :Taq MasterMix (Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTP 以及 PCR 稳定剂和增强剂组成的预混体系，浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．－种香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法，其特征在于包括以下步骤：（１）设计ＰＣＲ引物，其中：上游引物ＬＦ：５’－ＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣ－３’下游引物ＬＲ：５’－ＴＣＡＧＣＴＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＴＧＴＴ－３’；（２）对样本进行处理，得到样本中的ＤＮＡ；然后以样本的ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ反应，电泳检测ＰＣＲ产物，当ＰＣＲ产物呈现１７１ｂｐ条带，即样本中含有香蕉细菌性软腐病害病原菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林壁润，李培谦，沈会芳，蒲小明，潘群英，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：81
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。