一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法及应用技术

本发明专利技术属于农业生物有机肥料领域，特别涉及一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法及应用。本发明专利技术还涉及检测微生物发酵有机肥的方法，所述方法包括使用通过以上方法获得的总DNA的步骤。本发明专利技术的方法简单方便，产量、得率和浓度及纯度高且价格便宜。发明专利技术所得的DNA片段较完整、大小约为1500bp，浓度、纯度、得率高，所得DNA可直接作为PCR扩增的模板，以及生物发酵有机肥微生态学等方面的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法及应用
本专利技术属于农业生物有机肥料领域，特别涉及一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法及应用。
技术介绍
微生物发酵有机肥料中有60％～80％的微生物目前无法用传统的分离培养技术进行研究，从而阻碍了人们对其微生物结构及其多样性的客观认识。迄今为止，发酵有机肥料中只有极少部分微生物可以被培养，绝大多数还不为人所知。随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，发酵有机肥料微生物的研究也深入到了基因和作用机制水平，人们能避开了传统菌的群分离培养过程，直接从DNA水平上对这些菌群进行相关研究，从样品中提取高质量的、具有代表性的菌群总DNA是生物发酵肥料微生物生态学研究的基础。但是，由于以动物粪便为主的生物肥料不但组成成分复杂(含有多聚糖、胆酸、胆盐、胆色素、腐殖质、动物肠道脱落细胞及碎片、各种无机物和有机物等PCR的强抑制物)，而且粪便中细菌类型数目繁多，而不同细菌因其各自独特的细胞壁成分和结构，又对不同的提取方法的敏感程度有所差异，从而导致了不同方法的提取效率不尽相同，进而使得其菌群多样性分析结果不尽如人意，甚至造成偏差。目前微生物发酵有机肥样品中总DNA的提取并没有标准、统一的方法，因而，选择较好的DNA提取方法对肥料微生态研究非常关键。目前，国内外常用的DNA提取方法主要包括机械法，如硅珠法、冻融法等；化学法，如SDS法、苯酚法等；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等和商业试剂盒法。这几种类型的DNA提取方法中，机械法、化学法及酶或其组合方法是实验室常规提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超声波或反复冻融来裂解细胞释放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、二氧化硅等进行DNA的抽提，最后无水乙醇沉淀。这几种常规的提取方法的优点是：原理清楚，便于分析及查找实验中出现的问题，而不足之处在于所提取的DNA纯度不高或者得率较低，常含有大量的PCR抑制物，除微生物基因组外，还掺杂动物细胞、食物残渣的基因组DNA及杂质，纯度不够理想，需要进一步纯化处理才能用于后续的实验操作，如用蛋白酶裂解生物发酵有机肥的同时还另外用十六烷基三甲基溴化铵来除去PCR反应抑制物，并且还用酚-氯仿进行了多次的抽提才得到较高纯度的总DNA；在用蛋白酶K提取生物发酵有机肥样品总DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子来纯化得到总DNA。目前虽然有商业的试剂盒，但采用该试剂盒进行提取，所得总DNA浓度、得率低，并且试剂盒价格较昂贵、处理大批样品的科研成本太高，缺乏实验室通用性，不适于用于大规模生物发酵有机肥样品总DNA提取。另外由于专利等其它原因，试剂盒中具体成分及其含量不是很清楚，如果发生操作失败，很难分析找出实验失败原因。因此，需要找到一种新的能快速、高质、高效、廉价及无害提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的首先在于提供一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，该方法操作简单、快速、高效、高质，且价格经济，能适用于实验室大规模提取。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，包括如下进行的步骤：(1)预处理取微生物发酵有机肥样品，加入PBS缓冲液、浸泡、离心、收集沉淀，重复上述的操作步骤，至离心后上清液无色，弃上清液，收集沉淀物，记为沉淀物Ⅰ；(2)提取在沉淀物Ⅰ中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液，然后向上清液中加入枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液振荡混匀，于45-60℃水浴9-60分钟，离心，弃上清液，记为上清液Ⅰ，收集沉淀物；然后在收集的沉淀物中加裂解液和SDS溶液的混合液，并在温度低于25℃下使DNA复性，再次离心，取上清液，记为上清液Ⅱ，所述上清液Ⅱ中含有总DNA。本专利技术的方法主要包括生物发酵有机肥样品的预处理、样品DNA提取。以采集新鲜发酵有机肥样品或冻存的样品为材料，先用PBS缓冲液等对样品进行预处理，以获得样品菌悬液，再分别以枯草杆菌蛋白酶与SDS溶液组成的混合液、裂解液与SDS溶液组成的混合液进行提取，共同裂解细胞释放DNA。进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(1)中，第一次加入PBS缓冲液的量相当于所述微生物发酵有机肥样品体积的3-15倍，浸泡不少于5分钟；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1-3mLPBS溶液。优选的，所述步骤(1)中，第一次加入PBS缓冲液的量相当于所述微生物发酵有机肥样品体积的10倍，浸泡15分钟；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1mLPBS溶液。本专利技术所述的方法，所述步骤(1)中，也可采用其它可实现除杂质及离心分离功能的缓冲液替代PBS缓冲液。优选的，所述步骤(1)中，离心处理的条件为：4℃，10000转/分钟，离心至少3分钟。进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，在沉淀物Ⅰ中加入蒸馏水，重悬并离心，蒸馏水的加入量按照每200-300mg沉淀物Ⅰ添加1-3mL蒸馏水。优选的，蒸馏水的加入量按照每200-300mg沉淀物Ⅰ添加1mL蒸馏水。优选的，所述离心条件为10000转/分钟离心不少于3分钟。进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的体积比2-5：1-3，所述枯草杆菌蛋白酶的初始浓度为20±2mg/ml，所述SDS溶液的初始浓度为0.1-0.2mol/L。优选的，所述枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的体积比3：2，所述枯草杆菌蛋白酶的初始浓度为20mg/ml，所述SDS溶液的初始浓度为0.15mol/L。进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述上清液Ⅰ与加入的枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液体积比为1：10-20。。优选的，所述上清液Ⅰ与加入的枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液体积比为1：15。进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述裂解液与SDS溶液的体积比为20-50：30，所述SDS溶液的初始浓度为0.1-0.2mol/L。优选的，所述裂解液与SDS溶液的体积比为40：30，所述SDS溶液的初始浓度为0.15mol/L。进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述沉淀物Ⅱ与所述裂解液的体积比为1：10-20。优选的，所述沉淀物Ⅱ与所述裂解液的体积比为1：15。进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述初次离心的条件是：4℃，12000转/分钟，离心10分钟。进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述裂解液为Clelex-100。本专利技术的目的还在于提供简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法的应用，体现在检测微生物发酵有机肥中的应用、制备检测微生物发酵有机肥的试剂盒中的应用等。一种检测微生物发酵有机肥的方法，以本专利技术提取总DNA的方法所得的上清液Ⅱ中总D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：(1)预处理取微生物发酵有机肥样品，加入PBS缓冲液、浸泡、离心、收集沉淀，重复上述的操作步骤，至离心后上清液无色，弃上清液，收集沉淀物，记为沉淀物Ⅰ；(2)提取在沉淀物Ⅰ中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液，然后向上清液中加入枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液振荡混匀，于45‑60℃水浴9‑60分钟，离心，弃上清液，记为上清液Ⅰ，收集沉淀物；然后在收集的沉淀物中加裂解液和SDS溶液的混合液，并在温度低于25℃下使DNA复性，再次离心，取上清液，记为上清液Ⅱ，所述上清液Ⅱ中含有总DNA。

【技术特征摘要】
1.一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：(1)预处理取微生物发酵有机肥样品，加入PBS缓冲液、浸泡、离心、收集沉淀，重复上述的操作步骤，至离心后上清液无色，弃上清液，收集沉淀物，记为沉淀物Ⅰ；(2)提取在沉淀物Ⅰ中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液，然后向上清液中加入枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液振荡混匀，于45-60℃水浴9-60分钟，离心，弃上清液，记为上清液Ⅰ，收集沉淀物；然后在收集的沉淀物中加裂解液和SDS溶液的混合液，并在温度低于25℃下使DNA复性，再次离心，取上清液，记为上清液Ⅱ，所述上清液Ⅱ中含有总DNA。2.根据权利要求1所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，第一次加入PBS缓冲液的量相当于所述微生物发酵有机肥样品体积的3-15倍，浸泡不少于5分钟；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1-3mLPBS溶液。3.根据权利要求1所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的体积比2-5：1-3，所述枯草杆菌蛋白酶的初始浓度为20±2mg/ml，所述SDS溶液的初始浓度为0.1-0.2mol/L。4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马金平，王娟，
申请(专利权)人：新疆肥力沃生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆,65