等位基因变体检测方法、试剂盒及组合物技术

本发明专利技术提供利用阻滞子进行等位基因变体特异性检测的方法、试剂盒及组合物，所述方法包括向核酸样品中加入引物对及杂交过程中3’端不能被聚合酶延伸的阻滞子，所述引物对包括特异性引物及反向引物；所述特异性引物及反向引物分别与所述核酸样品中的靶序列突变型寡核苷酸杂交并产生扩增子；所述阻滞子与核酸样品中的靶序列野生型寡核苷酸杂交；利用所述荧光染料或所述检测指针对所述突变型等位基因进行实时特异检测。增加的阻滞子由于在扩增过程中无法延伸，抑制了野生型等位基因变体的扩增，因而提高了突变型等位基因变体的扩增效率，提高了检测的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因检测领域，更具体地说，涉及到一种利用等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)检测等位基因变体的方法试剂盒及组合物。
技术介绍
单核苷酸多态性(S NP)是人类基因组中最常见的遗传多样性的类型，其在人类基因组DNA中的发生频率为:1，000个核苷酸中有大约I个SNP，或更低。SNP牵涉于遗传病症、对不同疾病的易感性、对药物的不良反应的倾向性，以及用于法医研究。因此，SNP(或稀少突变)的检测为疾病早期诊断，例如检测血液中的循环癌细胞以进行出生前的诊断，以及用于检测混合的细胞群体中的疾病相关突变提供了巨大的潜在可能，而利用SNP鉴定与疾病或药物反应有关的靶基因是当前相关研究的焦点。基于涉及杂交、连接或DNA聚合酶的方法开发了多种用于SNP基因分型的方法。例如，等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)被广泛应用于检测DNA序列变异，然而，AS-PCR利用了 DNA聚合酶的保真度:相对于以匹配的3’碱基进行的引物延伸，以错配的3’碱基进行的引物延伸的效率要低得多，后者的效率为前者的1/100至1/100,000。然而，AS-PCR的特异性和选择性高度依赖于PCR的指数扩增性质，这使得PCR区分等位基因的能力随着扩增循环的增加而迅速降低。虽然引物可设计为匹配特异性变体以选择性地仅扩增该变体，但是在实际中，错配的引物经常仍然能够发生显著的扩增。此外，AS-PCR区分等位基因变体的能力会受到突变类型或者突变或SNP周围的序列的影响、存在于样品中的等位基因变体的量的影响、以及与备择等位基因之间的比例的影响。综合起来，这些因素常导致经常出现假阳性结果，使AS-PCR的可信度有待替提升。用于区分等位基因变体的另一种涉及探针杂交方法的技术是基因分型。然而，与AS-PCR—样，使用该方法的选择性受到局限，并且不适合于检测混合样品中的稀少(^ 1，000个中的I个)等位基因或突变。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的探针杂交方法例如AS-PCR或基因分型在等位基因的变体检测上检测率低的问题，提供一种等位基因变体检测方法、试剂盒及组合物。本专利技术就上述技术问题提供的技术方案如下:本专利技术提供一种等位基因变体检测方法，包括以下步骤:向核酸样品中加入突变型等位基因的特异性引物及其反向引物以及在杂交过程中3’端不能被聚合酶延伸的阻滞子，并加入荧光染料或检测指针，所述核酸样品中包含靶序列的突变型寡核苷酸及靶序列的野生型寡核苷酸，所述突变型寡核苷酸包含所述突变型等位基因，所述阻滞子与所述野生型寡核苷酸序列互补，所述野生型寡核苷酸包含野生型等位基因，所述突变型等位基因与所述野生型等位基因具有相同的基因座；所述靶序列的野生型寡核苷酸与所述阻滞子杂交，所述突变型寡核苷酸与所述突变型等位基因特异性引物及所述反向引物杂交并产生突变型扩增子；利用所述荧光染料或所述检测指针对所述突变型等位基因进行实时特异检测。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述特异检测包括:检测所述荧光染料的荧光变化或检测所述检测探针的可检测性质的变化来检测所述靶序列上的突变。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述突变型等位基因与所述野生型等位基因具有相同的基因座。本专利技术的等位基因变体检测方法中，对应于所述特异性引物的3’端的所述突变型寡核苷酸的至少一个核苷酸不同于所述野生型寡核苷酸的对应位置的核苷酸。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述阻滞子为吗啉基或异核酸。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述阻滞子与所述靶序列的突变型寡核苷酸之间的解离温度Tm低于所述突变型等位基因特异性引物与所述靶序列的突变型寡核苷酸之间的解离温度Tm。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述检测探针为基因座特异性检测探针。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述检测探针为5 ‘核酸酶探针。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述核酸样品中还包括所述聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸dNTP和/或适合于实时聚合酶链式反应PCR扩增的缓冲剂。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述聚合酶为Taq DNA聚合酶。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述检测探针为TaqMan探针。本专利技术的等位基因变体检测方法中,所述核酸样品为包含肿瘤细胞的血液样品。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述肿瘤细胞包含Ras、EGFR、Kit、pTEN、和/或P53中的突变。本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述Ras突变为KRAS突变或BRAF突变。本专利技术的等位基因变体检测方法中，检测所述KRAS突变时，使用两组所述特异性引物、阻滞子及反向引物，其对应关系为:第一组:特异性引物:AGGCACTCTTGCCTACGCCAT阻滞子:AGGCACTCTTGCCTACGCCAC反向引物:GTACTGGTGGAGTATTTGAT第二组:特异性引物:TCAAGGCACTCTTGCCTACGT阻滞子:TCAAGGCACTCTTGCCTACGC反向引物:GTACTGGTGGAGTATTTGAT本专利技术的等位基因变体检测方法中，所述突变为BRAF突变，使用的所述特异性引物、阻滞子及反向引物及检测探针的对应关系为:特异性引物:GCCTGATTTTGGTCTAGCTACAGA阻滞子:GCTACAGTGAAATCTC反向引物:AGCCTCAATTCTTACCACAAAA检测探针:(6-FAM) CAGACAACTGTTCAAACTG (BHQ)本专利技术还提供一种等位基因变体检测试剂盒，所述等位基因变体检测试剂盒中包括上述的特异性引物及其反向引物、阻滞子、以及荧光染料或检测指针。本专利技术还提供一种等位基因变体检测组合物，所述组合物包括上述特异性引物及其反向引物、阻滞子、以及荧光染料或检测指针。本专利技术提供的等位基因变体检测方法、试剂盒及组合物，通过利用阻滞子与靶序列野生型寡核苷酸杂交后无法延伸的特点，使得扩增过程中野生型等位基因变体的扩增受到抑制，因而提高了突变型等位基因变体的扩增效率，进而提高了检测的灵敏度和特异性。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中:图1为本专利技术的优选的吗啉基作为阻滞子与DNA分子杂交的示意图；图2为本专利技术的优选的异核酸结构中类似脱氧核糖的官能团结构示意图；图3为本专利技术的添加阻滞子的情况下靶序列的杂交示意图；图4为未使用阻滞子的情况下野生型核苷酸与引物对的杂交示意图；图5为使用本专利技术的检测方法检测KRAS突变的遗传序列示意图；图6为图5所示检测KRAS突变检测的的扩增曲线图；图7为利用本专利技术检测方法检测BRAF突变的遗传序列示意图；图8为图7 所示检测BRAF突变的检测结果中Ct值与肿瘤细胞与正常细胞的比值之间的关系图。具体实施例方式本专利技术主要涉及等位基因变体的检测方法、试剂盒及组合物。其中主要涉及到的术语具有如下定义:等位基因变体:出现在染色体某特定座位上的两个或多个基因中的一个的变体形式，所述变体包括单核苷酸多态性(SNP)、插入、反转、易位及缺失。引物:与靶序列的核苷酸链杂交的寡核苷酸。本专利技术中检测的等位基因来源于核算样品，所述核算样品可以使用任何核酸分子，可以是DNA，例如基因组DNA (gDNA)或互补性DNA (cDNA),也可以是RNA，例如信使RNA(mRNA)等。本专利技术的等位基因变体检测方法具体包括以下步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种等位基因变体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：向核酸样品中加入突变型等位基因的特异性引物及其反向引物以及在杂交过程中3’端不能被聚合酶延伸的阻滞子，并加入荧光染料或检测指针，所述核酸样品中包含靶序列的突变型寡核苷酸及靶序列的野生型寡核苷酸，所述突变型靶核苷酸包含所述突变型等位基因，所述阻滞子与所述野生型寡核苷酸序列互补，所述野生型寡核苷酸包含野生型等位基因，所述突变型等位基因与所述野生型等位基因具有相同的基因座；所述靶序列的野生型寡核苷酸与所述阻滞子杂交，所述突变型寡核苷酸与所述突变型等位基因的特异性引物及所述反向引物杂交并经扩增产生突变型扩增子；利用所述荧光染料或所述检测指针对所述突变型等位基因进行实时特异检测。

【技术特征摘要】
1.一种等位基因变体检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 向核酸样品中加入突变型等位基因的特异性引物及其反向引物以及在杂交过程中3’端不能被聚合酶延伸的阻滞子，并加入荧光染料或检测指针，所述核酸样品中包含靶序列的突变型寡核苷酸及靶序列的野生型寡核苷酸，所述突变型靶核苷酸包含所述突变型等位基因，所述阻滞子与所述野生型寡核苷酸序列互补，所述野生型寡核苷酸包含野生型等位基因，所述突变型等位基因与所述野生型等位基因具有相同的基因座； 所述靶序列的野生型寡核苷酸与所述阻滞子杂交，所述突变型寡核苷酸与所述突变型等位基因的特异性引物及所述反向引物杂交并经扩增产生突变型扩增子； 利用所述荧光染料或所述检测指针对所述突变型等位基因进行实时特异检测。2.根据权利要求1所述的等位基因变体检测方法，其特征在于，所述特异检测包括: 检测所述荧光染料的荧光变化或检测所述检测探针的可检测性质的变化来检测所述靶序列上的突变。3.根据权利要求1所述的等位基因变体检测方法，其特征在于，对应于所述特异性引物的3’端的所述突变型寡核苷酸的至少一个核苷酸不同于所述野生型寡核苷酸的对应位置的核苷酸。4.根据权利要求3所述的等位基因变体检测方法，其特征在于，所述阻滞子为吗啉基或异核酸。5.根据权利要求1所述的等位基因变体检测方法，其特征在于，所述阻滞子与所述靶序列的突变型寡核苷酸之间的解离温度Tm低于所述特异性引物与所述靶序列的突变型寡核苷酸之间的解离温度Tm。6.根据权利要求1-5任一项所述的等位基因变体检测方法，其特征在于，所述检测探针为基因座特异性检测探针；所述核酸样品中还包括所述聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸dNTP和/或适合于实时聚合酶链式反应PCR扩增的缓冲剂。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗晓腾，
申请(专利权)人：深圳联合医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：