致泻性大肠杆菌检测试剂盒及其检测分型方法技术

本发明专利技术适用于分子生物学及微生物检测技术领域，提供一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒及检测和分型方法，该检测试剂盒包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，还包括stp、sth、lt、aggR、eaeA、escV、stx1、stx2、ipaH基因的引物及探针SEQ?ID?NO:1-SEQ?ID?NO:27，还包括序列为SEQ?ID?NO:28的Homo-tag。该检测和分型方法包括以下步骤：获得并处理样品，加入至检测试剂盒中；进行荧光定量PCR反应；获得检测结果。本发明专利技术的检测和分型方法特异性好，灵敏度高，操作简便，结果易于判读，适用于对致泻性大肠杆菌的快速筛查和分型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学及微生物检测
，尤其涉及一种。
技术介绍
大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。而某些血清型菌株具有较强的致病性，可引起腹泻，此种菌株可通过饮食导致腹泻。致泻性大肠杆菌(DEC)是细菌性腹泻的常见病原菌，它包括肠致病性大肠杆菌(enteropathogenie E.coli, EPEC)> 肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenicE.coli, ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli, EIEC)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)和肠粘附性大肠杆菌(enteroaggregative E.coli,EAEC)。DEC感染主要见于婴幼儿，近年来其在成人腹泻病人中的检出率有所增加，并成为部分地区致腹泻的主要病原菌，且对常用药物出现了较高的耐药性，因此受到了广泛的关注。传统的分离培养技术是DEC鉴定、检测的标准方法，但常规的细菌培养与鉴定方法不足以将各种DEC鉴别开，因为许多血清型与基因型不一致。且传统方法需要经过一系列复杂的实验步骤，检测周期长，操作繁琐，准确性低，耗时费力，无法满足临床和实际工作的需要。DEC引起的临床症状多为水样腹泻，无法从症状判读型别指导临床用药，因此这需要既能快速检测又能实现多重检测。随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术已被广泛应用于细菌的检测和分类。然而常规PCR技术的后电泳容易导致污染， 易产生假阳性，使检测结果不准确。实时定量PCR以快速、准确等突出优点被广泛应用，但目前所采用的实时定量PCR方法多为单一的荧光定量PCR方法，只能检测一种致病菌，不能满足多重检测的要求，因此效率有待提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒，旨在解决现有检测技术中检测对象单一，检测效率低，准确度不高的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒，包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，还包括以下引物和探针:针对stp基因的引物和探针:stp-F:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAAAAAGCGAGTGCACCTCGACA-3’ (SEQ ID NO:1),stp-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGTTGACTGACTAAAAGAGGGG-3’(SEQ ID NO:2)，stp-probe:5，-CGCGTCTCAAATATCCGTGAAACAACATGACGCG-3’ (SEQ ID NO:3)；针对sth基因的引物和探针:sth-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTGGTCCTGAAAGCATGAATAG-3’ (SEQ ID NO:4)，sth-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAACAAAGCAACAGGTACATACG-3，(SEQ ID NO:5),sth-probe:5’-CGCGGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGCG-3’ (SEQ ID NO:6)；针对It基因的引物和探针:lt-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG-3’ (SEQ ID NO:7)，lt-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGTGGGAAACCTGCTAATCT-3’ (SEQ ID NO:8),lt-probe:5’-CGCCGGTATTACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCG-3’ (SEQ ID NO:9)；针对aggR基因的引物和探针:aggR-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGCAAAAGAAGAAATCAACAGT-3， (SEQ IDNO:10),aggR-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGAATCGTCAGCATCAGCTAC-3， (SEQ IDNO:11),aggR-probe:5’-CGGACAAAAGTAGATGCTTGCAGTTGTCCG-3’ (SEQ ID NO: 12)；针对eaeA基因的引物和探针:eaeA-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTAACCAGGCTTCGTCACA-3’ (SEQ ID NO: 13)，eaeA-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGAAAAAACGCTGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 14)，eaeA-probe:5，-CCCAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGG-3，(SEQ ID NO: 15)；针对escV基因的引物和探针:escV-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’ (SEQ IDNO:16)，escV-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGGAAAGAAGTTAGTTCAAGAGGAT-3’ (SEQ IDNO:17)，escV-probe:5，-CCCGCGCAACAGTTGTGGTGGATATCATTATCGCGGG-3， (SEQ ID NO:18)；针对stxl基因的引物和探针:stxl-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAASAGCGGTTACATTGTCTGGT-3，(SEQ ID NO:19)，stxl-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACTGCGTCAGTGAGGTTCCA-3’ (SEQ ID NO:20)，stxl-probe:5，-CCGCGTACGGGGATGCAGATAAATCGCGG-3’ (SEQ ID NO:21)；针对stx2基因的引物和探针:stx2-F: 5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACATGACAACGGACAGCAGTTA-3，(SEQ ID NO:22)，stx2-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCTGGTCATTGTATTACCACTGAA-3’ (SEQ IDNO:23)，stx2-probe:5，-CCGCCACTCACTGGTTTCATCATATCTGGCGG-3’ (SEQ ID NO:24)；针对ipaH基因的引物和探针:ipaH-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGAAAACCCTCCTGGTCCATC-3’ (SEQ ID NO:25)，ipaH-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTT-3， (SEQ IDNO:26)，ipaH-probe:5，-CCCGGCTGGAGGACATTGCCCGGG-3’ (SEQ ID NO:27)；其中各条探针序列5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团；该检测试剂盒还包括如下Homo-tag:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3，(SEQ ID NO:28)。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种致泻性大肠杆菌检测和分型方法，该检测和分型方法利用本专利技术的致泻性大肠杆菌检测试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒，包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，其特征在于，还包括以下9组引物和探针：针对stp基因的引物对SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2以及探针SEQ?ID?NO:3，针对sth基因的引物对SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5以及探针SEQ?ID?NO:6，针对lt基因的引物对SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8以及探针SEQ?ID?NO:9，针对aggR基因的引物对SEQ?ID?NO:10和SEQ?ID?NO:11以及探针SEQ?ID?NO:12，针对eaeA基因的引物对SEQ?ID?NO:13和SEQ?ID?NO:14以及探针SEQ?ID?NO:15，针对escV基因的引物对SEQ?ID?NO:16和SEQ?ID?NO:17以及探针SEQ?ID?NO:18，针对stx1基因的引物对SEQ?ID?NO:19和SEQ?ID?NO:20以及探针SEQ?ID?NO:21，针对stx2基因的引物对SEQ?ID?NO:22和SEQ?ID?NO:23以及探针SEQ?ID?NO:24，针对ipaH基因的引物对SEQ?ID?NO:25和SEQ?ID?NO:26以及探针SEQ?ID?NO:27，其中各条所述探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团；该检测试剂盒还包括序列为SEQ?ID?NO:28的Homo?tag。...

【技术特征摘要】
1.一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒，包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，其特征在于，还包括以下9组引物和探针: 针对stp基因的引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2以及探针SEQ ID N0:3, 针对sth基因的引物对SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5以及探针SEQ ID N0:6, 针对It基因的引物对SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8以及探针SEQ ID N0:9, 针对aggR基因的引物对SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11以及探针SEQ ID NO: 12, 针对eaeA基因的引物对SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14以及探针SEQ ID NO: 15, 针对escV基因的引物对SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17以及探针SEQ ID NO: 18, 针对stxl基因的引物对SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20以及探针SEQ ID NO:21, 针对stx2基因的引物对SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23以及探针SEQ ID NO:24, 针对ipaH基因的引物对S EQ ID NO:25和SEQ ID NO:26以及探针SEQ ID NO:27, 其中各条所述探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团； 该检测试剂盒还包括序列为SEQ ID NO:28的Homo-tag。2.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述9组引物和探针分装至两个反应管体系中，使 SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 12 与 SEQ ID N0:13_SEQ ID NO: 27分隔开。3.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为rTaq 酶。4.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述MgCl2的工作浓度为2-4mmol，所述dNTP的工作浓度为0.1-0.3mmol，所述DNA聚合酶工作浓度为0.8-1.2U。5.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述引物序列SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4, SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：扈庆华，石晓路，李迎慧，林一曼，邱亚群，陈琼城，陈清凉，姜伊祥，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：