一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法技术

本发明专利技术提供了一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，包括单核苷酸多态性位点的筛选、血浆中位点DNA的提取、PCR扩增反应、胎儿DNA量的计算等步骤。该方法操作方法简单，采用基于单核苷酸多态性位点的扩增，避免了使用Y染色体遗传位点标记难以测定孕女胎的孕妇血浆中胎儿游离DNA的含量，应用广泛、准确度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，还涉及该测定方法的应用，如产前检测。
技术介绍
当前，产前检测越来越受到人们的关注，产前检测是减少出生缺陷儿的有效措施之一。但是传统的侵入性诊断技术对母亲和胎儿都会造成一定的风险，因而在临床上限制了其运用。近年来，无创伤性产前诊断受到越来越多的关注，而孕妇血浆中胎儿游离DNA的发现无疑为无创伤性产前诊断开辟了新的途径。因此，围绕孕妇血浆游离DNA的研究越来越多，也发展出了许多潜在的临床应用。比如，母体血浆中胎儿DNA含量的异常与许多妊娠相关的疾病有关，包括先兆子痫、早产、产前出血、侵入性胎盘形成、胎儿唐氏综合症和其他胎儿染色体非整倍性。因此，母亲血浆的胎儿DNA分析可以作为监测胎儿健康的潜在标志物之一。然而，由于母亲血浆中胎儿游离DNA的含量只占总数的5%_30%，是处于一种高母体DNA的背景下，使得我们在进行无创产前诊断的过程中常常会因为胎儿游离DNA的含量过低而呈现假阴性的结果。为了同母亲来源的游离DNA区分，目前选取胎儿游离DNA标记物主要来自Y染色体遗传位点，这使得胎儿游离DNA含量的检测局限在怀男性胎儿的孕妇当中。因此，开发一种能够广泛应用的检测孕妇血浆中胎儿DNA含量的新技术，是一项意义深远的工作。
技术实现思路
专利技术目的:本专利技术的目的是提供一种操作简单、准确度高、应用广泛的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法。技术方案:本专利技术提供的一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，包括以下步骤:步骤一，单核苷酸多态性位点的筛选:从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的单核苷酸多态性位点库(dbSNP)中初步筛选出满足以下条件的单核苷酸多态性位点:(I)小等位基因频率(MAF)在0.4-0.5之间；(2)包含该多态性位点的DNA片段长度为50_70bp ；(3)位点上下游距离位点l_60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点；(4)包含该多态性位点的DNA片段不是位于基因组变异数据库中拷贝数变异范围之内；(5)该多态性位点所处的片段 在人类基因组范围内是特异的，保证该片段在人类基因组上是唯一的；(6)包含该多态性位点的DNA片段之间是相互兼容的，即该多态性位点的DNA片段之间，没有超过8bp的互补序列，同时各个多态性位点的DNA片段的GC含量应该在45-55%之间。步骤一中，单核苷酸多态性位点的筛选可利用软件完成，包括以下步骤:(以下步骤根据附附图说明图1得到，然而，该步骤及附图1并未显示筛选出该多态性位点的DNA片段长度为50-70bp ;此外，附图1上两端50_60bp不包含SNP位点请根据之前修改的权I修改)(1)从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的单核苷酸多态性位点库(dbSNP)中依据小等位基因频率数值过滤，提取出小等位基因频率在0.4-0.5之间的单核苷酸多态性位点，提取出的片段长度为50-70bp ；(2)将步骤(I)得到的单核苷酸多态性位点与人类基因组比较，提取出在人类基因组上是唯一的单核苷酸多态性位点；(3)过滤步骤(2)得到的单核苷酸多态性位点，提取出位点上下游距离位点l-60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点的单核苷酸多态性位点；(4)将步骤(3)得到的单核苷酸多态性位点与美国国立生物技术信息中心(NCBI)的基因组变异数据库(DGV)中拷贝数变异(CNV)信息进行比较，过滤掉包含拷贝数变异(CNV)信息的单核苷酸多态性位点；(5)将步骤(4)得到的单核苷酸多态性位点与BWA索引数据库比较，并过滤，使剩余的单核苷酸多态性位点的DNA片段之间是相互兼容的，即该多态性位点的DNA片段之间，没有超过8bp的互补序列，同时各个多态性位点的DNA片段的GC含量应该在45-55%之间。步骤二，血浆中位点DNA的提取:提取待测血浆中游离DNA，并分离出包括步骤一获得的位点序列的游离DNA片段:首先根据筛选出的位点设计探针；将探针绑定到生物磁珠上；将样品DNA加入到带有探针的生物磁珠中，使DNA与探针杂交；洗去多余的DNA模板；将绑定的样品DNA从生物磁珠上洗脱下来。步骤三，PCR扩增反应:对步骤一中获得的单核苷酸多态性位点序列设计PCR引物，并利用聚合酶链反应(PCR)扩增步骤二分离的游离DNA片段，得PCR扩增产物；步骤四，胎儿DNA量的计算:对步骤三获得PCR扩增产物测序，并统计分析每个位点的测序片段量，根据不同等位基因之间的比率，计算胎儿DNA的量。其中，步骤二中，所述待测血浆由以下方法获得:抽取5-10ml孕妇外周血，离心分离获得血浆。其中，步骤二中，包括步骤一获得的位点序列的游离DNA片段的分离方法，包括以下步骤:( 1)根据步骤一获得的位点序列设计探针；(2)将探针绑定到生物磁珠上；(3)将提取的待测血浆中游离DNA加入到带有探针的生物磁珠中，使DNA与探针杂交；(4)用商品化磁珠试剂盒中的清洗液洗去多余的DNA ；(5)用商品化磁珠试剂盒中的洗脱液将绑定的样品DNA从生物磁珠上洗脱下来。有益效果:本专利技术提供的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，操作方法简单，采用基于单核苷酸多态性位点的扩增，避免了使用Y染色体遗传位点标记难以测定孕女胎的孕妇血浆中胎儿游离DNA的含量，应用广泛、准确度高。该方法通过筛选获得特定单核苷酸多态性位点，能够准确测定胎儿DNA的含量，避免母亲来源的游离DNA影响出现假阴性的结果，准确性高。同时，本专利技术可采用第二代高通量测序平台，准确度高、数据量大、极大的降低了成本。说明书附1为本专利技术单核苷酸多态性位点的筛选方法的流程图。图2为本专利技术孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法的流程图。图3为本专利技术孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定结果。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。本专利技术所使用的试剂及软件分别为:试剂:QiAamp Blood Mini Kit (Qiagen)提取 DNA 试剂盒Taq DNA聚合酶 购自MBI公司dNTPs 购自 Τ0Υ0Β0 公司探针、引物由上海生物工程公司合成TruSeq DNA HT Sample Prep Kit Support (iIlumina)测序试剂盒ddH20普通重蒸水(自制)dNTP Τ0Υ0Β0 公司Buffer Takara 公司20 μ M正向引物上海生物工程公司20 μ M反向引物上海生物工程公司DNA聚合酶MBI公司IOngDNA提取的孕妇外周血血浆DNA软件:自编peri 脚本，BWA实施例1基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，包括以下步骤:步骤一，单核苷酸多态性位点的筛选:从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的单核苷酸多态性位点库(dbSNP)中初步筛选出满足以下条件的单核苷酸多态性位点:(I)小等位基因频率(MAF)在0.4-0.5之间；(2)包含该多态性位点的DNA片段长度为50_70bp ；(3)位点上下游距离位点l_60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点；(4)包含该位点的50_70bp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：?步骤一，单核苷酸多态性位点的筛选：从单核苷酸多态性位点库中初步筛选出满足以下条件的单核苷酸多态性位点：?（1）小等位基因频率在0.4?0.5之间；?（2）包含该多态性位点的DNA片段长度为50?70bp；?（3）位点上下游距离位点1?60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点；?（4）包含该多态性位点的DNA片段不是位于基因组变异数据库中拷贝数变异范围之内；?（5）该多态性位点所处的片段在人类基因组范围内是特异的；?（6）包含该多态性位点的DNA片段之间是相互兼容的，即该多态性位点的DNA片段之间，没有超过8bp的互补序列，同时各个多态性位点的DNA片段的GC含量应该在45?55%之间。?步骤二，血浆中包含位点序列游离DNA片段的提取：提取待测血浆中游离DNA，并分离出包括步骤一获得的位点序列的游离DNA片段；?步骤三，PCR扩增反应：对步骤一中获得的单核苷酸多态性位点序列设计PCR引物，并利用聚合酶链反应扩增步骤二分离的游离DNA片段，得PCR扩增产物；?步骤四，胎儿DNA量的计算：对步骤三获得PCR扩增产物测序，并统计分析每个位点的片段数量，根据不同等位基因之间的比率，计算胎儿DNA的量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNAi量的测定方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一，单核苷酸多态性位点的筛选:从单核苷酸多态性位点库中初步筛选出满足以下条件的单核苷酸多态性位点: Cl)小等位基因频率在0.4-0.5之间； (2)包含该多态性位点的DNA片段长度为50-70bp； (3)位点上下游距离位点l_60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点； (4)包含该多态性位点的DNA片段不是位于基因组变异数据库中拷贝数变异范围之内； (5)该多态性位点所处的片段在人类基因组范围内是特异的； (6)包含该多态性位点的DNA片段之间是相互兼容的，即该多态性位点的DNA片段之间，没有超过8bp的互补序列，同时各个多态性位点的DNA片段的GC含量应该在45-55%之间。步骤二，血浆中包含位点序列游离DNA片段的提取:提取待测血浆中游离DNA，并分离出包括步骤一获得的位点序列的游离DNA片段； 步骤三，PCR扩增反应:对步骤一中获得的单核苷酸多态性位点序列设计PCR引物，并利用聚合酶链反应扩增步骤二分离的游离DNA片段，得PCR扩增产物； 步骤四，胎儿DNA量的 计算:对步骤三获得PCR扩增产物测序，并统计分析每个位点的片段数量，根据不同等位基因之间的比率，计算胎儿DNA的量。2.根据权利要求1所述的一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA立量的测定方法，其特征在于:步骤一中，单核苷酸多态性位点的筛选可利用软件完成，包括以下步骤: (1)从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的单核苷酸多态性位点库(dbSNP)中依据小等位基因频率数值过滤，提取出小...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁波，孔令印，
申请(专利权)人：赛业苏州生物信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：