HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种检测HIV-1蛋白酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。具体而言，本发明专利技术还公开了检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的探针，包括检测蛋白酶基因D30N突变的探针、检测蛋白酶基因V32I突变的探针、检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的探针、检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的探针、检测蛋白酶基因G48V突变的探针、检测蛋白酶基因I50V突变的探针、检测蛋白酶基因I54V突变的探针、检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的探针、检测蛋白酶基因I84V突变的探针、检测蛋白酶基因N88D突变的探针、检测蛋白酶基因L90M突变的探针。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测Hiv-1蛋白酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。
技术介绍
一、蛋白酶抑制剂类药物及其作用机制获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmune Deficiency Syndrome, AIDS),又称艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原体为HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus,HIV),HIV属于逆转录病毒，分为HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地区的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。蛋白酶(Prote ase)对于HIV-1病毒中gag,gag-pol多聚蛋白和翻译后加工、形成病毒核心的结构蛋白以及其他基本的酶类，都是十分必要的。HIV-1病毒进入血液后，病毒表面的包膜蛋白gpl20和OT4 + T淋巴细胞表面的⑶4受体结合，在gp41透膜蛋白的作用下，侵入细胞并脱壳。蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitors，PIs)主要以氢键方式与HIV-1病毒蛋白酶的Asp25、GLy27、Asp29残基相互作用，与蛋白酶活性中的氨基酸残基形成立体相互作用，使病毒蛋白的长链不能裂开，从而抑制蛋白酶的活性，致使HIV在被感染的细胞中产生不成熟的、不具有感染性的病毒颗粒，从而达到使病毒不能正常装配，抑制HIV目的。自1994年肽底物类似物蛋白酶抑制剂问世以来，截至目前，经美国FDA批准上市的此类抑制剂已有10种，其中洛匹那韦(1pinavir/r, LPV)、阿扎那韦(atazanavir/r,ATv)、福沙普利那韦(fosamprenavir/r)和沙奎那韦(saquinavir/r, SQV)用于一线治疗，替拉那韦(fipranavir/r)和大诺那韦(darunavir/r)用于挽救治疗。这类药物能迅速降低血浆中HIV-1病毒载量，疗效突出，蛋白酶抑制剂已成为AIDS联合用药方案的重要组成部分，同时在补救治疗(Salvage therapy)中亦发挥重要作用。二、HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药类型及机制HIV蛋白酶是一个具有底物结合腔，呈中心对称的同型二聚体，在特定位点剪切大分子多肽前体，释放装配感染性病毒颗粒所必须的结构蛋白和酶。当缺少这些功能蛋白酶时，则只能生成没有感染能力的不成熟病毒颗粒。蛋白酶抑制剂对HIV蛋白酶活性位点均具强亲和力，可抑制酶的催化活性。蛋白酶抑制剂发生耐药的机制是HIV蛋白酶底物结合域或其远端位点的氨基酸置换，直接或间接修改了 PIs与酶接触位点的数量和性质，进而降低PIs与酶的亲和力。迄今已发现与Pls耐药相关的HIV-1突变有60多个，主要的耐药位点有23、30、32、47、48、50、82和84 ;位于边缘的46,54位点；位于酶内部的76,88和90。24、33、53和73位突变经常出现，这些位点对不同的Pls有不同的影响。L231、D30N、M46WL、G48V/M、184V、N88D/S和L90M突变会降低对奈非那韦(nelfinavlr, NFV)的敏感性;I50L、N88S和184V降低对ATV的敏感性；G48V/M、184V和L90M降低对SQV的敏感性；V321、147V/A、154L/M和184V降低对fosamprenavir/r的敏感性；V47A降低对LPV的敏感性；V82L/T与tipranavir/r耐药有关。有些突变可以增加一种或多种PIs的敏感性:I50L可以增加所有PIs的敏感性；I50V和154L可增加tipranavir敏感性；N88S可增加fosamprensvir敏感性；L76V可增加Alrv、SQV和fipranavir的敏感性。PI类耐药突变发生比较慢，多个位点突变才产生完全耐药，交叉耐药比较少见，耐药突变具有药物特异性。例如，D30N位点突变与NFV有关，150V突变与APV有关，G48V和L90M突变与SQV有关，I50L突变与ATV相关。然而，蛋白酶其他位点，如编码区82、84、90位点突变将产生交叉耐药。三、HIV-1的耐药检测方法目前HIV-1病毒耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的方法有直接测序法、异源双链轨迹试验(HTA)、PCR连续酶测定试验、线性探针试验、限制性内切酶酶切试验、引物特异的PCR测定、RNA酶A(RNase A)错配剪切试验等，其中部分技术已有商用系统。在进行基因测序后，将测序结果与标准病毒株比较后可坦福大学耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu/)及Los Alamos HIV耐药数据库。通过输入所测得的序列，数据库可自动提供病毒基因变异及耐药结果。目前已有基于测序技术的商品化的试剂盒:TRUEGENE HIV-1Genotyping Kit (Visible Genetics, Inc.Toronto, Canada)和 ViroSeq Kit (Applied Biosystems, Inc.Foster City, CA, USA)。两者都已获得美国FDA批准成为应用于临床常规检测的试剂盒。此外，基于线性探针技术(Line probe assay)的商品化的试剂盒 LiPA(Innogenetics,Ghent,Belgium)也已用于实验室研究。基因型检测的优点是可提供交叉耐药资料，可在样品收集后I 2周得到结果，技术步骤较少，一般情况下费用较便宜。但也存在明显缺点，即不直接提供药物的耐受程度，无法定量，部分变异位点与临床耐受的相关性无法完全确认，分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测通过病毒培养，再通过与无耐药性个体减少HIV复制50%或90%(50%or90%inhibitory concentration, IC50or IC90)所需的药物水平比较来分级耐药程度。表型分析的标准方法是首先从病人体内分离病毒，与待检药物共同培养，然后测定不同药物浓度下外周血单核细胞(PBMC)所产生的p24抗原量，据此得到IC5(I。该法步骤复杂，对操作技术要求高，整个过程至少需6周时间，病毒分离培养过程还有可能发生变异。重组表型方法将病人体内HIV-1的蛋白酶和逆转录酶基因序列进行RT-PCR扩增，扩增产物继而插入pol基因缺失型HIV-1载体以形成重组病毒，因此重组病毒保持了病人体内病毒对药物的敏感性，然后在不同药物，同一药物不同浓度下对重组病毒进行培养，即可测定出对药物的敏感性。表型耐药检测的结果与基因型检测结果通常相同，但有时亦有差异。当耐药HIV株水平较低时，表型检测可发现基因型检测所没有提示的耐药性变异。表型耐药是耐药检测的金标准，直接提供药物的耐受情况，可定量，但缺点也很明显，即技术要求高、费时、费用高昂，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。 基因型和表型检测的进一步应用限制，包括缺乏对现有检测方法的质量保证；检测费用较高；对微小病毒标本不敏感；如果存在耐药病毒，而病毒量又低于20%，现有检测方法很可能检测不到。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针，其特征是：包括以下11类特异性探针中的至少一类：检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:1~6中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:7~14中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:15~31中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:32~40中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:41~46中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:47~52中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:53~61中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:62~81中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:82~87中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:88~93中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:94~99中的任意一种或任意一种的互补序列。...

【技术特征摘要】
1.检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针，其特征是: 包括以下11类特异性探针中的至少一类: 检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针，为SEQ ID NO:1飞中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针，为SEQ ID NO:7 14中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 15 31中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的特异性探针，为SEQ ID NO:32^40中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:41 46中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:47 52中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 53 61中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针，为SEQ ID NO:62^81中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:82 87中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针，为SEQ ID NO:88 93中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针，为SEQ ID NO:94 99中的任意一种或任意一种的互补序列。2.根据权利要求1所述的检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针，其特征是: 所述检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针中，SEQ ID NO: f 3中的任意一种针对第30位氨基酸残基为D的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 4 6中的任意一种针对第30位氨基酸残基为N的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 7、中的任意一种针对第32位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 1(Γ 4中的任意一种针对第32位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因Μ46Ι和M46L突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 15 17中的任意一种针对第46位氨基酸残基为M的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 18 20中的任意一种针对第46位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID ΝΟ:2Γ31中的任意一种是针对第46位氨基酸残基为L的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因I47V和Ι47Α突变的特异性探针中，SEQ ID NO:32^34中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 35 37中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为A的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 38 40中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针中，SEQ ID NO:41 43中的任意一种是针对第48位氨基酸残基为G的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 44 46中的任意一种是针对第48位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针中，SEQ ID NO:47 49中的任意一种是针对第50位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:50^52中的任意一种是针对第50位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 53 55中的任意一种是针对第54位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:56^61中的任意一种是针对第54位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针中，SEQ ID NO:62^66中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 67 69中的任...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琼，李兰娟，项春生，吴南屏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：