本发明专利技术涉及一种检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒，包括HBVDNAPol基因区域扩增引物、HBVDNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液和PCR测序试剂，其中HBVDNAPol基因上游引物序列为SEQIDNo.1所示，HBVDNAPol基因下游引物序列为SEQIDNo.2所示。本发明专利技术的试剂盒检测灵敏度很高，特异性好，速度快，可在12~14小时完成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒，具体涉及一种利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒，属于医疗器械领域。
技术介绍
乙型肝炎是世界范围内最严重的健康问题之一，全球有约20亿人感染乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)，其中3. 5亿人呈慢性感染状态，中国约有1. 2亿HBV感染者，乙型肝炎感染是导致肝纤维化、肝衰竭和肝癌的主要原因。病毒产生耐药性是长期困扰乙型肝炎治疗的一大难题，HBV耐药会导致严重的临床后果，临床治疗时需要对HBV耐药性进行密切监测。目前，我国SFDA批准的一线抗乙肝药物(核苷类似物)，如拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)都存在不同程度的耐药情况。HBV发生耐药突变后，一方面使疗效降低甚至无效；另一方面会增加患者不必要的经济负担、造成医疗资源的浪费和流行病学危害。因此，通过基因变异检测来快速判断患者耐药与否及对哪种药物耐药，是指导医生用药，实现个体化医疗的前提和依据。国内外均有大量文献报道了 HBV核苷类似物的耐药变异LAM长期治疗慢性乙肝患者的研究结果显示，YMDD耐药突变的患者的Child-Pugh评分显著高于未发生YMDD突变的患者，肝病进展程度加剧。HBV逆转录酶YMDD区域的rtM204V (YVDD)或rtM204I (YIDD) 变异可直接导致对LAM强耐药。出现拉米夫定耐药时需改变治疗方案，选用ADV继续治疗。 与ADV相关的两个主要耐药突变为rtA181V和rtN236T，它们与LAM的YMDD突变位点没有重叠，无交叉耐药性。HBV对LdT的耐药发生率虽然低于LAM，但在长期治疗中也不容忽视，并且在HBeiVg阳性的患者中发生率更高。在YMDD变异的基础上，rtI169T、rtT184A/G/ I/S、rtS202G/I及rtM250V等进一步变异可形成HBV对ETV的耐药性。以上4种核苷类似物抗病毒药物的耐药位点均在大量临床实践中得以证实，检测这些耐药变异能帮助医生了解患者已发生对哪种药物的耐药，及时换药或联合用药，提高治疗效果。目前可用于HBV耐药突变检测的方法有探针杂交法、基因芯片法、质谱法、基因测序法等。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；质谱法难以在普通医疗机构开展；而基因测序法敏感性和特异性均高，操作相对简便，可高通量完成临床样品检测。目前尚无文献报道利用基因测序技术进行HBV全基因序列分析耐药突变检测的试齐U盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒。本专利技术利用基因测序技术，先设计了 HBV DNA Pol基因RT区扩增引物HBV DNA Pol 基因上游引物序列为5，-CTGCTGGTGGCTCCAGTT-3， HBV DNA Pol 基因下游引物序列为5，-GAGTTCCGCAGTATGGATCG-3， 本专利技术提供的利用基因测序技术检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒，包括HBV DNA Pol基因区域扩增引物、HBV DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液和PCR测序试剂，其中，HBV DNA Pol基因上游引物序列为 5，-CTGCTGGTGGCTCCAGTT-3，(SEQ ID No. 1) HBV DNA Pol基因下游引物序列为 5’-GAGTTCCGCAGTATGGATCG-3，(SEQ ID No. 2)其中 HBV DNA提取试剂为pH 8. O 的 10mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA、0. 5%(g/ml) 十二烧基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 150μ g/ml 蛋白酶 K。其中阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有已知型别的HBV样品为阳性对照。其中的PCR反应液包括10XPCR混合液、0. 25 pmol/μ L的引物、2. 5-4. O mM的 MgCl2,2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs、0. 3 0. 6 mM dUTP，取 Γ2 μ 1 的模板。其中PCR测序反应液包括4 μ L测序缓冲液，1 μ L DNA模板，1 μ L测序引物。用本专利技术的试剂盒检测临床待检者核苷类似物耐药突变基因，检测方法如下首先使用DNA提取试剂得到乙型肝炎病毒DNA，利用合成的PCR引物进行PCR扩增。扩增产物直接采用凝胶回收试剂盒进行快速凝胶回收，取回收DNA做测序反应，结束后采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，电泳前测序PCR产物在PCR仪上进行热变性，冰中骤冷，即可上基因测序仪测序。将HBV DNA测序结果与NCBI核酸数据库进行序列比对，查找逆转录酶区的202、204、173、180、181、169、236、184、202、250位点基因变异情况。同时，本试剂盒还可以发现未知的突变，为临床探讨新的突变位点与药物耐药之间关系的研究提供有效工具。本专利技术试剂盒的优点和有益效果如下(1)敏感基因测序技术是综合了 PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。(2)特异使用特异性标记的荧光素对定量分子进行识别，具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高、防污染。(4)快速速度快、高通量，可在12 14小时完成。附图说明图1标准HBV DNA核酸序列分析结果-M为标准HBV DNA测序结果，B为标准HBV DNA序列与NCBI核酸数据库中标准HBV DNA核酸序列比对结果，Ref代表标准HBV DNA编码氨基酸，Pat为提交序列核苷酸及编码氨基酸。图2患者HBV DNA核酸序列分析结果A为患者HBV DNA测序结果，红色箭头所示为突变的碱基，B为患者HBV DNA序列与NCBI核酸数据库中标准HBV DNA核酸序列比对结果，红色方框表示与标准序列比较发生突变的氨基酸形式，Ref代表标准HBV DNA编码氨4基酸，Pat为提交序列核苷酸及编码氨基酸。 具体实施例方式现结合实施例对本专利技术作进一步描述，但本专利技术的实施并不仅限于此。实施例1本专利技术试剂盒的制备本专利技术试剂盒组成如下(1)HBVDNA 提取试齐[J:10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 5mmol/L EDTA, 0. 5%SDS, 150μ g/ml蛋白酶K(2)引物HBV DNA Pol 基因上游引物序列为5，-CTGCTGGTGGCTCCAGTT-3， HBV DNA Pol 基因下游引物序列为5，-GAGTTCCGCAGTATGGATCG-3， 上述引物序列由上海Life Technology公司合成。(3)阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有HBV DNA样品为阳性对照。(4) PCR 反应液10 XPCR Premix(混合液)、0· 25 pmol/μ L 的引物、2. 5-4. 0 mM 的 MgCl2,2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs、0. 3 0. 6 mM dUTP、通常取 1 2 μ L 的模板。(5斤0 扩增程序的设定在4819700仪器上通常是先951 5 本文档来自技高网...
【技术保护点】
示，ＨＢＶ ＤＮＡ Ｐｏｌ基因下游引物序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示。１．一种检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒，其特征在于，包括ＨＢＶ ＤＮＡ Ｐｏｌ基因区域扩增引物、ＨＢＶ ＤＮＡ提取试剂、阴性对照和阳性对照、ＰＣＲ反应液和ＰＣＲ测序试剂，其中ＨＢＶ ＤＮＡ Ｐｏｌ基因上游引物序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，童永清，顾剑，郑红云，
申请(专利权)人：李艳，童永清，顾剑，郑红云，
类型：发明
国别省市：83
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