焦磷酸测序检测结核分枝杆菌卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法技术

本发明专利技术提供一种焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法，包括以下顺序步骤：步骤(1)，从痰液中直接提取核酸；步骤(2)，对结核分枝杆菌rrs基因进行特异性的PCR扩增；步骤(3)，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rrs基因是否具有突变位点。本发明专利技术提供的检测结核分枝杆菌对二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法可以从患者痰标本直接进行耐药性检测，并给出准确的耐药突变比例，无需再做分离培养结核分枝杆菌菌株，相比现在常用检测方法具有检测时间短，定量结果准确，操作简便，成本较低的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用焦磷酸序列分析法进行结核分枝杆菌基因耐药突变检测的方法，属于分子生物学

技术介绍
结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染性疾病，如果病人感染的结核分枝杆菌对一种或一种以上的抗结核药物产生了耐药性，即为耐药结核病。结核分枝杆菌耐药的发生主要通过以下三种机制：(1)细胞壁结构与组成发生变化，使得细胞壁通透性改变，降低药物通透性，产生降解或灭活酶类，改变药物作用靶位；(2)结核分枝杆菌中存在着活跃的药物外排泵系统，外排胞内药物，使得胞内药物浓度不能有效抑制或杀死结核分枝杆菌；(3)结核分枝杆菌基因组中药物作用靶基因或与药物作用相关酶基因序列的突变，导致药物失效而产生的耐药性，目前被认为是结核分枝杆菌产生耐药性的主要分子机制。这为结核菌耐多药(MDR：Multidrugresistance)乃至广泛耐药(XDR：Extensivelydrug-resistance)的快速分子诊断提供了理论依据。耐阿米卡星(AMK)、卡那霉素的结核杆菌中，16SrRNA基因突变率为67.4％，最常见的突变型是1401(A-G)的单碱基置换(60.5％)。少数分离株为1402(C-T或A)，1484(G-T)，这些突变主要发生于高水平耐药株，还有32.6％的耐卡那霉素分离株未发现16SrRNA基因突变，可能还存在其他耐药机制。卡那霉素(Kanamycin，KAN)和阿米卡星(Amikacin，AMK)是氨基糖苷类抗生素，它们结合到细菌核糖体30S亚基的16SrRNA，干扰甲酰甲硫氨酰tRNA(formyl-methionyl-tRNA)与30SrRNA的连接，阻断细菌蛋白质的合成，从而达到抑菌的作用。卷曲霉素(Capreomycin，CAP)为多肽复合物，对结核分枝杆菌起抑制作用，但作用机制尚不明确，可能与抑制细菌蛋白合成有关。卷曲霉素耐药与相关基因突变关系密切，包括16SrRNA基因和tlyA基因，但是，最主要的耐药基因是16SrRNA基因，大约78-80％的卷曲霉素耐药性与该基因的突变相关，特别是1401(A-G)的单碱基置换，突变率约为72％。WHO2008年报道显示，全球结核病总耐药率为20.0％，耐多药率为5.3％，由此造成的结核病患病率和死亡率居高不下。因此，快速准确的检测MTB耐药性成为结核病防治工作的当务之急，是制定恰当的治疗方案的重要依据。目前结核耐药检测常规方法多采用细菌学药敏方法，该方法所需时间长，不能及时为临床提供用药指导，而直接测序，费用昂贵，检测时间长。针对上述情况，本专利技术应用焦磷酸测序技术完成对受试物扩增产物的突变检测分析。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析出峰值的情况，达到实时测定DNA序列并精确分析序列变化的目的。由于焦磷酸测序技术操作简单，且结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。与其它方法相比，该方法具有特异性好，通量高，成本低，检测方法简便快速等优点。利用焦磷酸测序技术直接从痰液中检测结核分枝杆菌卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药基因的产品在技术上具备竞争优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便快速的结核分枝杆菌基因耐药突变的检测方法。为了达到上述目的，本专利技术提供一种利用焦磷酸测序技术直接从痰液样本中检测分析结核分枝杆菌对于二线药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药基因突变的方法。所述的方法包括对耐二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素相关的突变位点rrs1401的焦磷酸序列分析检测。其特征及具体步骤为：步骤1，从待测痰液样本中提取核酸；步骤2，使用荧光定量PCR仪对上步中提取的核酸进行扩增；步骤3，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rrs基因是否有耐药突变位点。在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法中，其中对rrs基因1401位点进行焦磷酸测序并设计引物。在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的方法中，其中所述对rrs基因进行PCR扩增，以痰标本结核杆菌DNA提取物为模板。在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的方法中，其中所述的扩增使用的PCR引物根据结核分枝杆菌rrs基因的高保守区域，设计多对引物，最优引物具有SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示序列，其中PCR扩增使用的引物SEQIDNO.2的5’端带有生物素标记。在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的方法中，其中所述PCR引物的最佳浓度为0.4μM，。在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的方法中，其中在焦磷酸测序中用的测序引物具有SEQIDNO.3所示序列，测序引物终浓度为800nM。在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌耐药性的方法中，其中所述PCR扩增反应过程包括下列顺序步骤：步骤1：在95℃下进行预热2分钟；步骤2：在95℃下保持30秒进行变性、60℃下保持30秒进行退火、72℃下保持30秒进行扩增和延伸，信号收集通道为“Green”，循环45次；步骤3：在72℃下保持5分钟。本专利技术提供的检测结核分枝杆菌耐药性的方法可以从患者痰标本直接进行对于二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素的耐药性检测，并给出准确的耐药突变比例，无需再做分离培养结核分歧杆菌菌株。相比常用的分离培养检测方法具有检测时间短，操作简便，成本较低的优点。并且市面上还没有除分离培养方法之外的检测结核分枝杆菌耐二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素的方法。由于rrs基因序列在各菌种之间差别不大，相对保守，这对结核分枝杆菌特异性的引物设计带来了挑战，并且市面上的rrs扩增引物往往具有非特异性扩增，对后续的测序灵敏度有不良影响。本专利技术PCR引物是根据结核分枝杆菌特异的rrs基因的高保守区域设计的，对于不含结核分枝杆菌的样本无法扩增。消除了非特异性扩增产物对后续焦磷酸测序反应的干扰，提高了焦磷酸测序的灵敏度。荧光定量PCR结果显示，使用此PCR引物扩增，无非特异性扩增产物，说明本专利技术提供的PCR引物特异性好；并且能够扩增低至1000拷贝/ml的结核分枝杆菌rrs基因片段，说明本专利技术提供的PCR引物扩增效率高。本专利技术特异性好，通量高，成本低，检测方法简便快速，耐药突变比例检测准确，可适用于于肺结核患者对抗结核二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素治疗的耐药辅助诊断及疗效检测。附图说明图1是本专利技术中突变比例为0％即野生型的标准株样本rrs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种焦磷酸测序技术直接从痰液中检测结核分枝杆菌二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法，其特征在于，包括以下顺序步骤：步骤(1)，从痰液中直接提取核酸，无需进行分离培养；步骤(2)，对结核分枝杆菌rrs基因进行特异性的PCR扩增；步骤(3)，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rrs基因是否具有突变位点。

【技术特征摘要】
1.一种焦磷酸测序技术直接从痰液中检测结核分枝杆菌二线注射类药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素耐药性的方法，其特征在于，包括以下顺序步骤：步骤(1)，从痰液中直接提取核酸，无需进行分离培养；步骤(2)，对结核分枝杆菌rrs基因进行特异性的PCR扩增；步骤(3)，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rrs基因是否具有突变位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述从痰液中直接提取核酸，该核酸提取过程的步骤6为95℃金属浴加热15min，冷却至室温，简短离心以去除管盖内壁的水珠。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)针对rrs基因1401位点进行PCR扩增，PCR引物浓度为0.4μM。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的PCR引物是根据结核分枝杆菌rrs基因特...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐梅波，张亚飞，林敏，王洁，吴非，
申请(专利权)人：凯杰苏州转化医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32