一种检测HER3突变的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种检测HER3突变的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒主要包括9对PCR引物及9条测序引物。本发明专利技术的试剂盒可以准确分析靶基因特定位点突变和定量分析混合细胞群体的等位基因频率，具有灵敏度高、特异性强、耗时短的优点，检测方法快速精准，操作简便。

A kit for detecting HER3 mutation and its detection method

The present invention provides a kit for detecting HER3 mutation and its detection method. The kit mainly includes 9 pairs of PCR primers and 9 sequencing primers. The kit of the invention can accurately analyze the target gene specific loci mutation and quantitatively analyze the allelic frequency of the mixed cell population, and has the advantages of high sensitivity, high specificity and short time consumption. The detection method is fast and precise, and the operation is simple.

【技术实现步骤摘要】
一种检测HER3突变的试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测HER3突变的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
人类表皮生长因子受体(Humanepidermal-growth-factorreceptor，HER)家族包括EGFR(erbB1/HER1)、HER2、(erbB2/neu)、HER3(erbB3)和HER4(erbB4)四个家族成员，属于I型受体酪氨酸激酶家族(Receptortyrosinekinase,RTKs)。HER与配体结合后激活，形成同型二聚体或异型二聚体，调节MAPK通路或激活PI3K/AKT通路参与细胞的信号传递，在细胞内通过激酶级联传递信号，最终调节细胞的生长及分裂，并参与肿瘤细胞的增殖、浸润及血管生成等。HER家族蛋白与乳腺癌、肺癌及黑色素瘤等众多肿瘤的临床病理特征及预后密切相关。HER3又称erbB3，其mRNA为6.2Kb糖基化的蛋白，分子量为160kd，含1342个氨基酸残基。HER3激酶调控区包含6个能与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)的亚单位P85结合的位点，所以HER3成为PI3K及蛋白激酶B信号转导通路的主要激活因子，从而调控肿瘤细胞生长、凋亡、浸润、转移等过程。有研究显示HER3在各种肿瘤组织中存在过表达，其过表达可能系转录(mRNA)或转录后水平(蛋白合成)的上调引起，在临床肿瘤中发挥生物学作用的是受体蛋白。除造血组织外的正常组织细胞均有HER3蛋白的表达，表明HER3在正常细胞分化增殖中起着不可忽视的生理作用。据报道，在结肠癌和胃癌中有11％发生HER3突变，在胆囊癌中有11.8％发生HER3突变，非小细胞肺癌、卵巢癌和脑胶质瘤也有不同比例的HER3突变。HER3基因突变改变了细胞上皮的非配体依赖方式，影响了细胞正常的分化和增殖，从而导致癌变。体内实验显示抗体类和小分子抑制剂可以有效抑制突变HER3调节的致癌作用和癌症的进程。虽然目前尚无针对HER3靶点的药物上市，但越来越多的公司和机构参与HER3药物的研发，有些已进入临床阶段。而检测HER3突变是指导HER3靶向药物使用的前提和基础。目前，HER3突变的检测方法主要为直接测序法，测序法从样本准备到测序结果解读，效率低，耗时长，需2天左右时间；且直接测序法检测灵敏度低，对于突变率较低的情况，直接测序的方法几乎难以实现其准确检测，会导致大量的漏检和假阴性的发生。因此，直接测序等技术远不能达到其实际应用的需求。因此，研发高效灵敏的检测试剂盒及方法检测HER3突变对于提高患者的生存率，延长生存期，避免过度化疗，提高生存质量有着重大意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种检测HER3突变的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒能够实现简便、快速检测HER3基因突变，所述试剂盒采用焦磷酸测序的方法，所述焦磷酸测序的方法具有特异性好，检测方法简便快速，能够给出具体突变比例等优点，利用焦磷酸测序技术检测肿瘤样本HER3基因突变的产品在技术上具备竞争优势。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种检测HER3突变的试剂盒；所述试剂盒包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.18所示，所述测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.19-27所示；所述扩增引物的核苷酸序列具体如下：SEQIDNO.1:TATGTCCTCGTGGCCATGAAT；SEQIDNO.2:AACATGACGAAGATGGCAAACT；SEQIDNO.3:AGACCATCTGTGCTCCTCAGTG；SEQIDNO.4:GCCACATCCCAATTTCAGAAC；SEQIDNO.5:TTGGGATGTGGCCTTTGA；SEQIDNO.6:ACTGATACTTGGTGTGGGGATTG；SEQIDNO.7:AACCCAATCCCCACACCAAG；SEQIDNO.8:ATCATTGTTCCTTCCCCTCAGAC；SEQIDNO.9:GTGGACTCGAGCAACATTGATG；SEQIDNO.10:GCTGGGGTCTAAGGAGGGAAG；SEQIDNO.11:CAAGATCCCTGCCCTGGAC；SEQIDNO.12:GGGCAAACTCTCTGCCACT；SEQIDNO.13:TATTTGCCTCTGGGTTCTCTGCT；SEQIDNO.14:GGCTTCTCTCACCTTGGCAATTT；SEQIDNO.15:GGAACATGGTATGGTGCATAGAA；SEQIDNO.16:ATCAGGAGGCAGCAGGTCAG；SEQIDNO.17:CAGTTTGGGAGTTGATGACCTTCG；SEQIDNO.18:CACACTTGACCATCACCATGTAG。所述测序引物的核苷酸序列具体如下：SEQIDNO.19:TCCCATCGTAGACCTG；SEQIDNO.20:CCTGAGCAGCCCCCG；SEQIDNO.21:TTAGCTTGTTGTAGACAAGA；SEQIDNO.22:CCCACACCAAGTATCA；SEQIDNO.23:ATTGATGGATTTGTGAAC；SEQIDNO.24:CTGTGATCTCCCGTACT；SEQIDNO.25:GGGGCACTGGGGCCA；SEQIDNO.26:CGAAACGTGCTACTCAAG；SEQIDNO.27:TGCAGATCTGGGGCTGT。本专利技术的试剂盒采用焦磷酸测序技术，完成对HER3扩增产物的突变检测分析。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是一种边合成边测序的测序技术，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光反应偶联，通过检测荧光的释放和强度，实时测定DNA序列并精确分析序列变化。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析出峰值的情况，达到实时测定DNA序列并精确分析序列变化的目的。焦磷酸测序技术操作简单，且结果准确可靠。本专利技术中，所述试剂盒通过采用上述的扩增引物和测序引物能够准确地对HER3的9个突变频率较高的位点进行检测，从而实现肿瘤的检测。优选地，所述试剂盒还包括甘油和/或甜菜碱，优选为甘油和甜菜碱的组合。由于焦磷酸测序要求PCR产物不能过长，导致引物设计区域受限，为检测方便，且要求这9对引物在同一条件下进行扩增，这对特异性高的PCR扩增带来了挑战；而非特异性的扩增，对后续的测序灵敏度有不良影响。本专利技术为了提高引物扩增特异性，在PCR扩增体系中添加了甘油和甜菜碱。荧光定量PCR溶解曲线结果显示，添加甘油和甜菜碱之后，扩增特异性大大提高，消除了非特异性扩增产物对后续焦磷酸测序反应的干扰，提高了焦磷酸测序的灵敏度。优选地，所述甘油的质量分数为2-4％，例如可以是2％、3％或4％，优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测HER3突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.18所示，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19‑SEQ ID NO.27所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测HER3突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.18所示，所述测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.19-SEQIDNO.27所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括甘油和/或甜菜碱，优选为甘油和甜菜碱的组合；优选地，所述甘油的质量分数为2％-4％，优选为3％；优选地，所述甜菜碱的摩尔浓度为0.25M-0.5M，优选为0.4M；优选地，所述试剂盒还包括焦磷酸测序的常规试剂；优选地，所述常规试剂包括：琼脂糖凝胶珠、吸附缓冲液、退火缓冲液、测序酶、测序底物、10×洗液、变性液、dATPаS、dCTP、dGTP或dTTP中的任意一种或至少两种的组合。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增引物、测序引物、甘油、甜菜碱和焦磷酸测序的常规试剂；所述扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.18所示，所述测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.19-SEQIDNO.27所示；所述甘油的质量分数为2％-4％，所述甜菜碱的摩尔浓度为0.25M-0.5M；所述常规试剂包括：琼脂糖凝胶珠、吸附缓冲液、退火缓冲液、测序酶、测序底物、10×洗液、变性液、dATPaS、dCTP、dGTP或dTTP中的任意一种或至少两种的组合。4.一种应用如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒检测HER3突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取肿瘤组织样本基因组DNA；(2)对基因组DNA的HER3基因的9个位点进行PCR扩增；(3)对PCR产物进行焦磷酸测序，检测9个位点的突变。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的9个位点包括104位点、232位点、262位点、284位点、355位点、389位点、809位点、846位点和928位点。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的引物包括：所述104位点扩增使用的PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述232位点扩增使用的PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述262位点扩增使用的PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；所述284位点扩增使用的PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；所述355位点扩增使用的PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洁，王瑜，张亚飞，吴叶君，申爱丽，吴子侠，
申请(专利权)人：凯杰苏州转化医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32