用于对核酸测序的场效应装置和方法制造方法及图纸

本公开提供了用于对核酸测序的方法。方法可以包括聚合酶催化的针对核酸模板将核苷酸掺入新生核酸链中，其中将聚合酶附着于电荷传感器，所述电荷传感器检测核苷酸掺入事件。可以使用各自在电荷传感器处产生独特签名的一种或多种非天然核苷酸类型来独特鉴定模板核酸中的不同核苷酸。

Field effect devices and methods for nucleic acid sequencing

The present disclosure provides a method for sequencing of nucleic acids. The method can include polymerase catalyzed incorporation of nucleotides into new nucleic acid chains for nucleic acid templates, where polymerase is attached to a charge sensor, and the charge sensor detects nucleotide incorporation events. One or more kinds of non natural nucleotide types, which can generate unique signature at the charge sensor, can be used to uniquely identify different nucleotides in template nucleic acid.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于对核酸测序的场效应装置和方法本专利技术是在国家一般医学科学研究所(NationalInstituteofGeneralMedicalSciences)授予的资助号1R01-GM106957的政府支持下完成的。美国政府对本专利技术具有一定的权利。专利技术背景本公开一般涉及基于生物传感器的检测，并且更具体地涉及可以用于核酸测序的生物传感器。目前可用于测序DNA的商业平台相对昂贵。这些平台中的大多数使用“合成测序”方法，这由于在检测每个单体(即核苷酸)添加到正在增加的聚合物结构时合成DNA聚合物而如此称谓。因为模板DNA链严格地指导新DNA聚合物的合成，所以可以从合成期间添加到生长链中的一系列核苷酸单体推断模板DNA的序列。监测反应使用相对昂贵的硬件，如激光、检测光学和复杂的流体递送系统。迄今为止最成功的商业平台还需要昂贵的试剂和硬件来扩增DNA模板，然后才能开始合成测序。这些平台的复杂性和成本已经阻碍了它们在一些明确需要DNA测序技术的临床和研究环境中的使用。因此，需要对核酸测序平台进行改进，使其更具成本效益，快速和方便。本公开解决了这种需要并也提供了其它优点。专利技术概述本公开提供了核酸测序的方法。方法可以包括以下步骤：(a)提供附着于固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)使所述聚合酶与核苷酸三磷酸的混合物接触，其中所述混合物包含不同类型的核苷酸三磷酸，其中第一类核苷酸三磷酸与所述混合物中其它类型的核苷酸三磷酸相比处于可区分的状态，其中第二类核苷酸三磷酸与所述混合物中其它类型的核苷酸三磷酸相比不处于可区分的状态，并且其中所述聚合酶针对模板核酸链将来自所述混合物的核苷酸掺入新生链；(c)经由所述电荷传感器检测所述核苷酸的掺入，其中所述第一类核苷酸三磷酸产生与由所述混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号相比独特的信号，从而获得第一信号模式；(d)使用所述聚合酶、所述模板核酸、和核苷酸三磷酸的第二混合物重复步骤(b)和(c)，其中所述第二类核苷酸三磷酸与所述第二混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比处于可区分状态，并且其中所述第一类核苷酸三磷酸与所述第二混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比不处于可区分状态，从而获得第二信号模式；并且(e)比较所述第一和第二信号模式以测定所述模板核酸的序列。还提供了核酸测序的方法，其包括以下步骤：(a)提供附着于固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)使所述聚合酶与核苷酸三磷酸的混合物接触，其中所述混合物包含不同类型的核苷酸三磷酸，其中前两类(afirsttwotypes)核苷酸三磷酸与所述混合物中的后两类(asecondtwotypes)核苷酸三磷酸相比处于第一可区分状态，并且其中所述聚合酶针对模板核酸链将来自所述混合物的核苷酸掺入新生链；(c)经由所述电荷传感器检测所述核苷酸的掺入，其中所述前两类核苷酸三磷酸产生与由所述混合物中的后两类核苷酸三磷酸产生的信号区分的信号，从而获得第一信号模式；(d)使用所述聚合酶、所述模板核酸、和核苷酸三磷酸的第二混合物重复步骤(b)和(c)，其中所述前两类核苷酸三磷酸之一与所述第二混合物中的前两类核苷酸三磷酸中另一种相比处于可区分状态，从而获得第二信号模式；并且(e)比较所述第一和第二信号模式以测定所述模板核酸的序列。附图简述图1显示了固定在SWNTFET上的单一酶图2显示了通过系链(tether)附着到电荷传感器的聚合酶。图3显示了纳米线电荷传感器附近的DNA聚合酶I的Klenow片段的带电残基。图4A显示了聚合酶活性的催化循环。图4B显示了在核苷酸掺入引发的(primed)模板核酸期间通过附着到SWNTFET的聚合酶检测到的示例性信号。图5显示了在掺入天然的和经磷酸盐修饰的dATP期间(左)；以及在掺入2-硫代dTTP期间(右)通过附着到SWNTFET的聚合酶检测的示例性信号。图6A显示了γ-ANS核苷酸修饰的化学结构。图6B显示了来自聚合酶加工天然(dATP)和γ-ANS修饰的核苷酸(dTTP)的混合物的FRET信号。用γ-ANSdTTP的闭合状态的持续时间比天然核苷酸长>10倍，允许测定碱基的身份。图7A和图7B显示了在使用附着到SWNTFET的聚合酶的测序反应期间，可以用于独特鉴定掺入核酸中的四种不同核苷酸类型的参数组合。如所示，组合极性反转和动力学修饰的经修饰的核苷酸可以编码四种不同的碱基。图8A和图8B显示了在任何时间，聚合酶与三种天然的和一种修饰的dNTP的混合物接触的测序方案。四个不同运行的电流迹线的比对允许DNA的全部四种碱基的独特鉴定。图9A和图9B显示了在任何时间，聚合酶与两种天然的和两种经修饰的dNTP的混合物接触的测序方案。两个不同运行的电流迹线的比对允许DNA的四种碱基的独特鉴定。图10显示高持续合成能力(processivity)聚合酶，其配置为对环状模板进行测序，作为提高准确性并且比对围绕模板的“圈(laps)”的电流迹线的手段，其使用具有不同类似物的dNTP混合物(例如，在不同圈中存在的不同核苷酸修饰)进行。专利技术详述一般地，本公开的实施方案涉及在诸如在核酸测序程序中检测的核苷酸掺入事件等应用中可用于单分子检测的装置、组合物和方法。需要改进的检测系统，其以高通量方式提供长测序读段。在本文中阐述的本专利技术的实施方案满足了这种需要并且也提供了其它的优点。本公开提供了用于对核酸测序的方法。该方法利用聚合酶催化的针对核酸模板将核苷酸掺入新生核酸链中。可以将聚合酶附着到检测核苷酸掺入事件的电荷传感器上。各自在电荷传感器上产生独特签名(signatures)的一种或多种非天然核苷酸类型可以用于独特鉴定模板核酸中的不同核苷酸。在一些实施方案中，与混合物中的其它核苷酸相比，存在于混合物中的一种或多种非天然核苷酸将产生具有反转极性的信号变化。或者/另外，在混合物中使用的一种或多种非天然核苷酸将产生核苷酸掺入的延迟或降低的掺入速率。或者/另外，在该方法中使用的一种或多种非天然核苷酸将产生显著改变的信号高度。可以在聚合酶活性期间检测这些信号参数以区分非天然核苷酸互补的模板核酸中的核苷酸。在具体的实施方案中，存在于非天然核苷酸中的非天然部分或修饰可以产生聚合酶构象的改变(与由缺乏该部分或修饰的核苷酸产生的构象相比)，从而产生由与聚合酶附接的电荷传感器检测到的一个或多个信号参数的独特签名。示例性的信号参数包括但不限于信号持续时间、信号高度、信号上升时间、信号下降时间、信号极性、信号噪声等。该方法的一些实施方案利用了四种不同类型的核苷酸三磷酸的混合物，其中核苷酸三磷酸类型之一与其它三类(即“高”核苷酸)相比以实质性更低的量或浓度(即“低”核苷酸)存在。因此，低核苷酸的掺入将作为相对延迟或降低的掺入速率而可检测到。可以利用此签名来鉴定与低核苷酸互补的核苷酸类型在模板中的位置。对于同一模板可以完成几个测序运行，其中每个运行用“低”状态的不同核苷酸进行。可以比较来自不同运行的信号模式以测定模板的序列。上述实施方案以核苷酸三磷酸的3“高”-1“低”混合物例示。也可以使用其它混合物，包括例如1“高”-3“低”混合物或2“高”-2“低”混合物。在美国专利No.7,556,922中提出了关于使用具有不同浓度的核苷酸的混合物的其它有用配置，该专本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸测序的方法，其包括：(a)提供附着于固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)使所述聚合酶与核苷酸三磷酸的混合物接触，其中所述混合物包含不同类型的核苷酸三磷酸，其中第一类核苷酸三磷酸与所述混合物中其它类型的核苷酸三磷酸相比处于可区分的状态，其中第二类核苷酸三磷酸与所述混合物中其它类型的核苷酸三磷酸相比不处于可区分的状态，并且其中所述聚合酶针对模板核酸链将来自所述混合物的核苷酸掺入新生链；(c)经由所述电荷传感器检测所述核苷酸的掺入，其中所述第一类核苷酸三磷酸产生与由所述混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号相比独特的信号，从而获得第一信号模式；(d)使用所述聚合酶、所述模板核酸、和核苷酸三磷酸的第二混合物重复步骤(b)和(c)，其中所述第二类核苷酸三磷酸与所述第二混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比处于可区分状态，并且其中所述第一类核苷酸三磷酸与所述第二混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比不处于可区分状态，从而获得第二信号模式；并且(e)比较所述第一和第二信号模式以测定所述模板核酸的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.12 US 62/160,4601.核酸测序的方法，其包括：(a)提供附着于固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)使所述聚合酶与核苷酸三磷酸的混合物接触，其中所述混合物包含不同类型的核苷酸三磷酸，其中第一类核苷酸三磷酸与所述混合物中其它类型的核苷酸三磷酸相比处于可区分的状态，其中第二类核苷酸三磷酸与所述混合物中其它类型的核苷酸三磷酸相比不处于可区分的状态，并且其中所述聚合酶针对模板核酸链将来自所述混合物的核苷酸掺入新生链；(c)经由所述电荷传感器检测所述核苷酸的掺入，其中所述第一类核苷酸三磷酸产生与由所述混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号相比独特的信号，从而获得第一信号模式；(d)使用所述聚合酶、所述模板核酸、和核苷酸三磷酸的第二混合物重复步骤(b)和(c)，其中所述第二类核苷酸三磷酸与所述第二混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比处于可区分状态，并且其中所述第一类核苷酸三磷酸与所述第二混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比不处于可区分状态，从而获得第二信号模式；并且(e)比较所述第一和第二信号模式以测定所述模板核酸的序列。2.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的所述可区分状态包括附着于所述第一类核苷酸三磷酸的非天然部分。3.权利要求2的方法，其中步骤(d)中的所述可区分状态包括附着于所述第二类核苷酸三磷酸的非天然部分。4.权利要求2的方法，其中所述可区分状态包括与步骤(d)相比步骤(b)中的不同非天然部分。5.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的所述可区分状态包括与所述第一混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸的量或浓度相比所述第一类核苷酸三磷酸的较低的量或浓度。6.权利要求5的方法，其中步骤(d)中的所述可区分状态包括与所述第二混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸的量或浓度相比所述第二类核苷酸三磷酸的较低的量或浓度。7.权利要求1的方法，其还包括使用所述聚合酶、所述模板核酸、和核苷酸三磷酸的第三混合物重复步骤(b)和(c)的步骤，其中第三类核苷酸三磷酸与所述第三混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比处于可区分状态，并且其中所述第一类和第二类核苷酸三磷酸与所述第三混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比不处于可区分状态，从而获得第三信号模式。8.权利要求7的方法，其中步骤(e)包括比较所述第一、第二和第三信号模式以测定所述模板核酸的序列。9.权利要求7的方法，其还包括使用所述聚合酶、所述模板核酸、和核苷酸三磷酸的第四混合物重复步骤(b)和(c)的步骤，其中第四类核苷酸三磷酸与所述第四混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比处于可区分状态，并且其中所述第一类、第二类和第三类核苷酸三磷酸与所述第三混合物中的其它类型的核苷酸三磷酸相比不处于可区分状态，从而获得第四信号模式。10.权利要求9的方法，其中步骤(e)包括比较所述第一、第二、第三和第四信号模式以测定所述模板核酸的序列。11.权利要求1的方法，其中所述模板核酸链是环状的。12.权利要求1的方法，其中所述混合物中的核苷酸三磷酸的不同类型补足所述模板核酸链中的四种不同核苷酸。13.权利要求12的方法，其中所述第二混合物中的核苷酸三磷酸的不同类型补足所述模板核酸链中的四种不同核苷酸。14.权利要求1的方法，其中所述电荷传感器是电荷传感器阵列的部分，其中步骤(a)包括提供各自附着到所述阵列中的固体支持物电荷传感器的多个聚合酶。15.权利要求14的方法，其中步骤(b)包括使所述聚合酶与核苷酸三磷酸的混合物接触；并且步骤(c)包括经由所述阵列中的所述电荷传感器检测所述核苷酸的掺入。16.权利要求1的方法，其中在步骤(c)期间，所述第一类核苷酸三磷酸产生具有极性的信号变化，所述极性与由所述混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化中的极性相反。17.权利要求16的方法，其中在步骤(d)期间，所述第二类核苷酸三磷酸产生具有极性的信号变化，所述极性与由所述第二混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化中的极性相反。18.权利要求1的方法，其中在步骤(c)期间，所述第一类核苷酸三磷酸产生与由所述混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化相比信号变化的延迟。19.权利要求18的方法，其中在步骤(d)期间，所述第二类核苷酸三磷酸产生与由所述第二混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化相比信号变化的延迟。20.权利要求1的方法，其中在步骤(c)期间，所述第一类核苷酸三磷酸产生与由所述混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化相比信号变化的减弱强度。21.权利要求20的方法，其中在步骤(d)期间，所述第二类核苷酸三磷酸产生与由所述第二混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化相比信号变化的减弱强度。22.权利要求1的方法，其中在步骤(c)期间，所述第一类核苷酸三磷酸产生与由所述混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化相比信号变化的增加强度。23.权利要求22的方法，其中在步骤(d)期间，所述第二类核苷酸三磷酸产生与由所述第二混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化相比信号变化的增加强度。24.权利要求1的方法，其中在步骤(c)期间，所述第一类核苷酸三磷酸产生与由所述混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化相比延长的信号变化。25.权利要求24的方法，其中在步骤(d)期间，所述第二类核苷酸三磷酸产生与由所述第二混合物中的其它核苷酸三磷酸产生的信号变化相比延...

【专利技术属性】
技术研发人员：KL冈德森，白净卫，陈呈尧，JG曼德尔，S佩萨乔维克，B博亚诺夫，PG柯林斯，GA韦斯，
申请(专利权)人：亿明达股份有限公司，加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US