基于高通量测序的三段式探针扩增方法技术

本发明专利技术提供了一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，包括如下步骤：(1)基因组DNA的杂交和连接；(2)PCR扩增反应；(3)Qubit测浓度，Qseq看条带大小，二代测序。本申请的方法可以用10元试剂成本检测至少200个SNP位点，检测成本节约，检测结果的准确度大于98％以上。

Three segment probe amplification method based on high throughput sequencing

The invention provides a three segment probe amplification method based on high-throughput sequencing, including the following steps: (1) hybridization and connection of genomic DNA; (2) PCR amplification reaction; (3) Qubit concentration, Qseq size and two generation sequencing. This method can be used to detect at least 200 SNP loci with 10 yuan reagents, and the cost saving can be detected. The accuracy of the test results is more than 98%.

【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序的三段式探针扩增方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法。
技术介绍
多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)于2002年由Schouten等首先报道，是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。传统的MLPA是一种检测遗传性疾病基因缺失和重复突变的髙通量有效新技术，能对DNA序列进行定性和半定量分析，这一特点使得该技术在检测单核苷酸多态性(SNP)和点突变，染色体的非整倍性改变，以及几种常见的儿童遗传病如智力低下综合征，X连锁型智力低下，假肥大型肌营养不良症等。一种基于高通量测序的SNP检测方法的技术方案：探针设计，预扩增及biotin标记，杂交，连接，Barcode特异性引物扩增，测序，根据测序结果来分析样品的SNP位点信息。一种基于MLPA的基因拷贝数和突变的高通量测序检测方法：在MLPA技术环节中，对PCR扩增环节或其前后环节进行改造，使PCR产物带有可进入高通量测序的接头序列并上机测序。对所得数据分析后获得每个探针扩增的Reads数，进以计算模板拷贝数或基因突变情况。接头序列中可置入用于区分不同样本的标签序列，因而本技术在确保检测拷贝数的高精确性的同时，实现了检测位点的高通量性和检测样本的高通量性。毛细管电泳不能区分长度相同或相近的片段，产物设计不能一样长，因而每次只能检测有限的位点数，同时长探针的制备较为复杂而且合成成本高，出错率提高。传统的两段式MLPA技术检测的准确度和灵敏性以及数据的可靠性与本专利技术中的三段式探针连接扩增技术相比存在错误率高、灵敏性差、成本高。传统的MLPA技术需要杂交、连接分步操作，而本技术将杂交和连接同时反应完成。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，通过探针人工设计合成，探针与变性模板杂交，杂交后探针的连接，PCR扩增，最后用高通量测序的方法对其检测达到基于诊断的目的。本专利技术的目的是通过以下方案实现：一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，包括如下步骤：(1)基因组DNA的杂交、连接并纯化；(2)PCR扩增反应；(3)Qubit测浓度，Qseq看条带大小，二代测序；所述步骤(1)中杂交的探针包括左探针、右探针和中间探针；所述左探针、右探针和中间探针的序列设计时必需与目标靶序列一条链互补，左探针、右探针和中间探针设计时三者之间不能有缺口。优选地，所述步骤(1)中的左探针、右探针的长度大小在没有添加通用引物序列时大于23个寡核苷酸，小于50个寡核苷酸；中间探针的长度为5个寡核苷酸序列。优选地，所述步骤(1)中的左探针的5’端前面添加一段通用序列CCTACACGACGCTCTTCCGATCT；右探针的3’末端添加一段通用序列TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAAC。优选地，所述步骤(1)的连接反应的酶包括NEB公司的TaqDNALigase、HiFiTaqDNALigase、9°NTMDNALigase、E.coliDNALigase和QIAGENTaqDNALigase。优选地，所述步骤(1)中杂交和连接的体系为：优选地，所述杂交和连接的程序为：94℃5min60℃90min4℃∞上述产物：1x磁珠纯化。优选地，所述步骤(2)中PCR条件如下：1)98℃预变性30sec2)98℃变性10sec3)55℃退火30sec4)72℃延伸15sec2)-4)循环次数30次5)72℃延伸5min6)4℃延伸∞上述产物：1.8X磁珠纯化。优选地，所述PCR体系为22μl体系，具体如下：优选地，所述4系列引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5barcode]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；所述8系列引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7barcode]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。本方法是基于传统的MLPA技术基础上对其改造，其原理是通过探针人工设计合成，探针与变性模板杂交，杂交后探针的连接，PCR扩增，最后用高通量测序的方法对其检测达到基于诊断的目的。传统的MLPA是两段式的方式设计，本研究用的是三段式探针连接扩增技术，相比于传统的两段式三段式更准确，杂交的错误率更低，对探针设计的要求更高。中间探针的设计更为灵活，长度的可变空间较大。左右两边的探针长度大于23个寡核苷酸不能多于50个寡核苷酸。本研究的优势还在于能在同一个反应体系中同时完成杂交，连接过程。本研究具有操作简单，耗时短，成本低，高通量，检测位点多等优势。高通量体现在二代测序的平台的优越性，一次反应可以同时检查多达几百个位点，且数据的真实可靠性也能大幅度提高。三段式探针连接扩增技术应用的领域有但不限于拷贝数变异、SNPs、基因组重测序对已有报道的物种进行测序，寻找基因差异等。探针设计：针对每个位点设计三条探针，分别是左探针，右探针，中间探针，其中左探针的5’端前面添加一段通用序列CCTACACGACGCTCTTCCGATCT大小是23个寡核苷酸，右探针的3’末端添加一段序列TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAAC大小是24个寡核苷酸。三条探针序列设计时必需与目标靶序列一条链互补，左中右三条探针设计时三者之间不能有缺口。左右探针的设计时长度大小在没有添加通用引物序列条件下大于23个寡核苷酸，尽量小于50个寡核苷酸，退火温度尽量大于60℃。中间探针的长度大小为5个寡核苷酸序列，该技术中所有检测位点的中间探针都是相同的长度即5个核苷酸序列。第二轮PCR扩增的通用序列分别是AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5barcode]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT正向引物CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7barcode)GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA反向引物。i5barcode和i7barcode分别是二代测序不同的6个或8个index序列，用于区分不同样品的标签序列。所有的4和8系列引物只有i5barcode和i7barcode不同，它们是6个或8个不同的碱基组合序列，目的是为了区分不同的上机样本。大量的样本上机只能用不同的index序列加以区分。每个位点的中间探针和右探针在合成时还需要在5’端进行磷酸化修饰，目的是让前后两个探针之间能形成磷酸二酯键。连接5’端磷酸基团和3’端羟基的连接酶有TaqDNA连接酶、9°NTMDNA连接酶、HiFiTaqDNA连接酶、T4DNA连接酶等但不限于目前这几种，每个位点只有当我们设计的三段探针左中右序列分别正确杂交到模板上，DNA连接酶能够催化磷酸二酯键的形成，使与同一互补靶DNA链杂交的两条相邻寡核苷酸链的5′-磷酸末端和3′-羟基末端通过磷酸二酯键相连。该连接反应只有当两条寡核苷酸链与互补靶DNA完全配对，并且两条寡核苷酸链之间没有空隙的条件下才可发生。所有探针稀释混合，每条探针先稀释到1uM。所有位点各取左右探针0.8ul，中间探针2.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)基因组DNA的杂交、连接并纯化；(2)PCR扩增反应；(3)Qubit测浓度，Qseq看条带大小，二代测序；所述步骤(1)中杂交的探针包括左探针、右探针和中间探针；所述左探针、右探针和中间探针的序列设计时必需与目标靶序列一条链互补，左探针、右探针和中间探针设计时三者之间不能有缺口。

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)基因组DNA的杂交、连接并纯化；(2)PCR扩增反应；(3)Qubit测浓度，Qseq看条带大小，二代测序；所述步骤(1)中杂交的探针包括左探针、右探针和中间探针；所述左探针、右探针和中间探针的序列设计时必需与目标靶序列一条链互补，左探针、右探针和中间探针设计时三者之间不能有缺口。2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)中的左探针、右探针的长度大小在没有添加通用引物序列时大于23个寡核苷酸，小于50个寡核苷酸；中间探针的长度为5个寡核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)中的左探针的5’端前面添加一段通用序列CCTACACGACGCTCTTCCGATCT；右探针的3’末端添加一段通用序列TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAAC。4.根据权利要求1所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)的连接反应的酶包括NEB公司的TaqDNALigase、HiFiTaqDNALigase、9°NTMDNALigase、E.coliDNALigase和QIAGENTaq...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁学芬，肖哲，焦少灼，张嫒媛，王云鹏，戚珠云，王琦童，
申请(专利权)人：美因健康科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11