Taqman探针检测APOE的方法及所用的引物和探针技术

本发明专利技术提供了一种使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法，包括如下步骤：(1)正常人群口腔拭子基因组提取；(2)设计APOE引物及探针；(3)使用APOE的引物和探针对基因组进行PCR(聚合酶链式反应)；(4)PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型；(5)综合2个探针检测的结果，对个体的APOE基因进行综合评估。本发明专利技术的taqman引物及探针具有良好的分型效果，能非常准确的确定个体的基因型。

Taqman probe for detecting APOE and primers and probes used

The present invention provides a method for APOE gene detection using Taqman probe method, including the following steps: (1) genome extraction from oral swabs of normal people; (2) APOE primers and probes are designed; (3) APOE primers and probes are used for PCR (polymerase chain reaction); (4) fluorescence reading is performed after the end of PCR, and the probes are carried out. Genotyping; (5) combined the results of 2 probe detection, the APOE gene of individuals was comprehensively evaluated. The TaqMan primer and probe of the invention have good typing effect and can determine the genotype of an individual very accurately.

【技术实现步骤摘要】
Taqman探针检测APOE的方法及所用的引物和探针
本专利技术涉及分子生物学，尤其涉及一种使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法及所使用的引物和探针。
技术介绍
APOE基因位于19号染色体，编码载脂蛋白E(APOE)，是同时存在于血清和中枢神经系统中的脂质相关蛋白，它作为低密度脂蛋白受体的配体参与乳糜微粒和极低密度脂蛋白的清除，维持机体脂质代谢平衡，APOE在血浆中的浓度一定程度上决定了血浆中血脂的水平。该蛋白不仅在脂类代谢中起到重要作用，而且参与其他重要的生物功能，如免疫调节和神经通路调节(神经元修复和重塑)等。目前APOE基因检测结果能评估与APOE蛋白功能密切相关的心脑血管系统疾病易感风险。目前易感基因筛查的主要手段为一代测序、二代测序及荧光定量PCR。一代及二代测序虽然准确性比较高，但成本高昂，耗时较长。taqman探针法检测SNP位点具有快速、准确、成本低等一系列优点。在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们可分别与2个等位基因完全配对。正常情况下，由于探针5′端荧光基团和3′端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被TaqDNA聚合酶5′→3′外切酶活性切割，致使探针5′端上的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针，表明另一对等位基因不能被有效切割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测。
技术实现思路
为了解决本领域存在的问题，基于APOE基因上的rs429358和rs7412SNP位点可用来评估与APOE蛋白功能相关的心脑血管疾病易感风险性，本专利技术提供了一种使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法。本专利技术的目的是通过以下方案实现：一种使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法，包括如下步骤：(1)口腔拭子基因组的提取；(2)确定APOE引物和探针；(3)使用APOE的引物和探针对步骤(1)的基因组进行PCR反应；(4)PCR结束后进行荧光读取和基因分型；(5)综合探针检测的结果，对APOE基因进行评估。优选地，所述步骤(1)中的提取方法为使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，使用200μL口腔拭子保存液保存，经400μL细胞裂解液裂解细胞释放出基因组DNA，后选择性沉淀去除蛋白，纯净的基因组DNA通过400μL异丙醇沉淀并重溶解于50μLDNA溶解液中备用。优选地，所述步骤(2)中的引物包括rs429358位点的引物和rs7412位点的引物。优选地，所述rs429358位点的引物的核苷酸序列如下：Forwardprimer：5'-CCGCGGTACTGCACCAG-3'Reverseprimer：5'-GGACGAGACCATGAAGGAGTT-3'所述rs429358位点的探针的核苷酸序列如下：P1-C：5'-FAM-CCGCGCACGTCCT-MGB-3'P1-T：5'-VIC-CGGCCGCACACGT-MGB-3'。优选地，所述rs7412位点的引物的核苷酸序列如下：Forwardprimer：5'-CCCCGGCCTGGTACACT-3'Reverseprimer：5'-CTGCGCAAGCTGCGTAA-3'所述rs7412位点的探针的核苷酸序列如下：P2-C：5'-FAM-CAGGCGCTTCTGCA-MGB-3'P2-T：5'-VIC-CCAGGCACTTCTGCA-MGB-3。优选地，所述步骤(3)的PCR反应体系为10μl：优选地，所述PCR条件如下：95℃，15min；95℃，30s，60℃1min，35个循环。本专利技术的另一方面为用于Taqman探针法进行APOE基因检测的引物和探针，所述引物包括rs429358位点的引物和rs7412位点的引物；所述探针包括rs429358位点的探针和rs7412位点的探针。优选地，所述rs429358位点的引物的核苷酸序列如下：Forwardprimer：5'-CCGCGGTACTGCACCAG-3'Reverseprimer：5'-GGACGAGACCATGAAGGAGTT-3'所述rs429358位点的探针的核苷酸序列如下：P1-C：5'-FAM-CCGCGCACGTCCT-MGB-3'P1-T：5'-VIC-CGGCCGCACACGT-MGB-3'。优选地，所述rs7412位点的引物的核苷酸序列如下：Forwardprimer：5'-CCCCGGCCTGGTACACT-3'Reverseprimer：5'-CTGCGCAAGCTGCGTAA-3'所述rs7412位点的探针的核苷酸序列如下：P2-C：5'-FAM-CAGGCGCTTCTGCA-MGB-3'P2-T：5'-VIC-CCAGGCACTTCTGCA-MGB-3。本专利技术中所指的提取方法为使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，使用200μL口腔拭子保存液保存，经400μL细胞裂解液裂解细胞释放出基因组DNA，后选择性沉淀去除蛋白，纯净的基因组DNA通过400μL异丙醇沉淀并重溶解于50μLDNA溶解液中备用。本专利技术中所指的特异性引物对是指针对APOE基因上的rs429358和rs7412SNP位点的引物对，能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。设计这些特异性引物对由本实验室技术人员完成，由引物合成公司合成，引物合成使用常规的引物合成手段即可。本专利技术中所指的特异性taqmanMGB探针对是指针对APOE基因上的rs429358和rs7412SNP位点的探针对，能够通过荧光定量PCR方法特异性检测出这2个SNPs位点基因型的taqman探针对。设计这类taqman探针是本领域技术人员可轻易完成的，由本实验室人员设计，由引物合成公司合成，引物合成使用常规的探针合成手段合成即可。APOErs429358SNP位点有3个基因型CC、CT和TT；rs7412SNP位点有3个基因型TT、CT、CC。APOE基因定位于19号染色体，编码载脂蛋白E。本专利技术提供的利用TaqmanMGB探针检测人APOE基因多态性的方法，能高通量检测其SNP位点，结果容易判读。每次单板可以检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。本专利技术使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易。可对APOE基因的SNP位点实现高通量检测，在对人进行心脑血管疾病发病概率分析中具有潜在的应用价值。附图说明图1是rs429358SNP位点3个基因型CC、CT和TT的检测结果；图2是rs7412SNP位点3个基因型TT、CT、CC的检测结果。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术进行详细的解释。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1利用TaqmanMGB探针检测人APOE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)口腔拭子基因组的提取；(2)确定APOE引物和探针；(3)使用APOE的引物和探针对步骤(1)的基因组进行PCR反应；(4)PCR结束后进行荧光读取和基因分型；(5)综合探针检测的结果，对APOE基因进行评估。

【技术特征摘要】
1.一种使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)口腔拭子基因组的提取；(2)确定APOE引物和探针；(3)使用APOE的引物和探针对步骤(1)的基因组进行PCR反应；(4)PCR结束后进行荧光读取和基因分型；(5)综合探针检测的结果，对APOE基因进行评估。2.根据权利要求1所述的使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取方法为使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，使用200μL口腔拭子保存液保存，经400μL细胞裂解液裂解细胞释放出基因组DNA，后选择性沉淀去除蛋白，纯净的基因组DNA通过400μL异丙醇沉淀并重溶解于50μLDNA溶解液中备用。3.根据权利要求1所述的使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的引物包括rs429358位点的引物和rs7412位点的引物。4.根据权利要求3所述的使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法，其特征在于，所述rs429358位点的引物的核苷酸序列如下：Forwardprimer：5'-CCGCGGTACTGCACCAG-3'Reverseprimer：5'-GGACGAGACCATGAAGGAGTT-3'所述rs429358位点的探针的核苷酸序列如下：P1-C：5'-FAM-CCGCGCACGTCCT-MGB-3'P1-T：5'-VIC-CGGCCGCACACGT-MGB-3'。5.根据权利要求3所述的使用Taqman探针法进行APOE基因检测的方法，其特征在于，所述rs7412位点的引物的核苷酸序列如下：Forwardprimer：5'-CCCCGGCCTGGTACACT-3'Reverseprimer：5'-CTGCGCAAGCTGCGTAA-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冠冬，肖哲，焦少灼，王利辉，陶园，尹朝华，师妍，
申请(专利权)人：美因健康科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11