口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法技术

本发明专利技术提供了一种口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，包括如下步骤：口腔拭子粗处理，制得稀释后的样品—PCR扩增—SNP分型鉴定。本发明专利技术的方法直接PCR进行SNP分型，节省了提取DNA的步骤。

A method of SNP typing by direct PCR in oral swabs

The present invention provides a method for SNP typing of direct PCR for oral swabs, including the following steps: the rough treatment of the oral swabs and the preparation of the diluted samples - PCR amplification - SNP typing identification. The method of the invention is directly PCR for SNP typing, and saves the steps of extracting DNA.

【技术实现步骤摘要】
口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法
本专利技术涉及SNP分型方法，尤其涉及一种口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms)，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。SNP在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。有些SNP位点还会影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究(如生物的起源、进化及迁移等方面)和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。目前所涉及检测SNP的技术中，无一例外的是以DNA为模板。由于样品之间的巨大差异，DNA与RNA的分离提取过程也千差万别，这项工作对于操作人员的技术熟练程度要求颇高。传统分离提取技术由于要使用一些毒性较强的化学试剂，长期接触，将对操作人员的身体造成不可逆的伤害，甚至在实验过程中造成直接的损害。同时，对于有大量样品需要研究的人员，分离提取核酸则是一项劳动量极大的工作。现在市场上核酸分离提取试剂盒已经成熟，品牌众多，但大致都相同。无论是硅胶膜柱离心式试剂盒还是磁珠法试剂盒，都需要大量的时间，且成本高昂。除试剂盒成本外，更是对实验室仪器设备有特殊要求，磁珠法所采用的自动化工作站就是非常典型的大型高价值设备，对实验室而言，是一项巨大的费用支出。Taqman探针PCR反应体系中含有一对双标记的探针和一对PCR引物，用两种荧光染料Fam，Hex(Vic)分别标记这两种探针，TaqMan探针上有一个荧光发光基团(reporterdye简称R基团)和一个荧光猝灭基团(quencher简称Q基团)，完整的探针上的这两个基团靠的很近，R基团发出的荧光在Q基团的吸收波长范围内，则会被Q基团吸收，因此不会产生荧光，当探针与模板结合，上游引物(5’端的)延伸到探针结合的地方时，利用聚合酶(Taqpolymerase)的5’-3’的外切酶活性把探针降解，同时把R基团从探针上游离下来，使它和猝灭集团分开，这时就会产生荧光，最后通过终点读板检测信号来确定是否存在SNP位点。
技术实现思路
本专利技术提供了一种口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，本专利技术以细胞裂解液对口腔拭子进行粗处理，进行简单的离心除杂后，便可进行SNP分型，避免了提取DNA的繁琐步骤，本专利技术实验过程中所用聚合酶为强耐受性DNA聚合酶。本专利技术的目的是通过以下方案实现：一种口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，包括如下步骤：口腔拭子粗处理，制得稀释后的样品—PCR扩增—SNP分型鉴定；所述PCR扩增中采用强耐受性DNA聚合酶。优选地，所述口腔拭子粗处理的方法为向口腔拭子保存管中加入200μl细胞裂解液后室温裂解10min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，12,000×g，离心10min，吸取上清液至96孔板中；所述稀释是指用蒸馏水将细胞液稀释5倍制得稀释后的样品。从裂解开始，之后通过离心去除表皮细胞，最后是通过5倍稀释，经过这些操作得到可以用于PCR的样品。在此过程当中，我们未额外的使用任何试剂或仪器，用最简单的方法完成，这个预处理的流程是本申请首创的。优选地，所述强耐受性DNA聚合酶选自上述中的一种。优选地，所述PCR体系如下：优选地，所述探针和引物包括4个SNP位点的探针和引物，具体如下：SNP位点1：上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT探针1：TAGTATGGAAGAAATC探针2：TAGTAGTATGGCAGAAATSNP位点2：上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT下游引物：CTGTCATGCACTTATATTTATCTAGTTTGAAG探针1：AGATGCCACGTAGAAG探针2：AGATGCCATGTAGAAGTSNP位点3：上游引物：ACAGGGCTGTGGGACAAGTC下游引物：GGCGTTACAATTAAAGAGAGAGAGAGA探针1：CATTCCGGTAAGCAG探针2：ATTCCGGTAGGCAGCSNP位点4：上游引物：TGCATGTATTTTGTGGAAAAATCTG下游引物：TGGACAAGACTTGAGAAGGTGTGT探针1：CTAAGGCAATTTAAAC探针2：ACTAAGGCACTTTAAA。优选地，所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。优选地，所述PCR条件如下：①预变性：95℃，5min；②变性：95℃，10s；退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；③12℃，forever；退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规PCR下的温度。退火温度越低非特异扩增越高，提高退火温度可有效减少非特异性扩增。但提高的范围需要摸索，本专利技术经摸索后确定将退火温度提高1℃效果最好。优选地，所述SNP分型鉴定是指使用Bio-tek读取荧光值，利用Klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型。大量实验数据表明，PCR反应的灵敏度极高，只需要以少量模板便可完成扩增过程。以往的过程当中通过提取DNA，以高纯度的DNA为模板进行扩增，而这个过程中所用DNA通常是过量的。那么，当细胞被裂解后释放出的DNA的含量则完全可以满足PCR过程。但是，此时的DNA中往往掺杂了大量杂质，这些杂质会严重影响后续的分型鉴定。为了消除杂质的影响，我们将口腔拭子粗处理液进行简单的稀释，希望通过稀释降低体系中的杂质含量。此时，DNA中杂质的量被大大减少，而DNA含量也可以满足扩增过程。此外，在PCR反应当中，虽然杂质的含量被大大降低，但是一般的DNA聚合酶仍然会在一定程度上受到杂质的影响。导致其不能与模板正常结合从而抑制PCR扩增，造成产物量降低。为了尽可能的消除影响，我们以强耐受性DNA聚合酶进行PCR扩增，这种酶具有很强的PCR反应抑制物耐受性，能以待测样本的裂解液为模板，进行高效特异性扩增。而尤为关键的是，虽然强耐受性DNA聚合酶可以保证引物的有效扩增，但是如果探针与模板的结合效率较低将仍然不能监测到荧光信号，其结果也无法正常分型。通过试验比对发现：当探针Tm值较低分型效果越好(不超过60℃)，我们推测在杂质并存的环境下会影响探针与模板的结合，而Tm值越高的探针虽然特异性提高但是结合效率却大大降低；相反，Tm较低的探针往往越容易与模板结合。综上，本专利技术先是将口腔拭子进行粗处理得到可以进行下游试验的样品，接着使用强耐受性DNA聚合酶保证引物的有效扩增，同时使用Tm较低的探针保证探针与模板的有效结合，最终得到满意的分型效果。本专利技术发现Tm值较低的探针更有利于directPCR进行SNP分型，而探针Tm值完全人为可控，所专利技术的方法无需进行DNA提取过程，当以口腔拭子粗裂解液为模板时可应用所有的SNP位点，大大降低了实验成本，提高了工作效率。附图说明图1为SNP位点1的分型结果；图2为SNP位点2的分型结果；图3为SNP位点3的分型结果；图4为SNP位点4的分型结果；附图1-4中，A为directPCR分型结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：口腔拭子粗处理，制得稀释后的样品—PCR扩增—SNP分型鉴定；所述PCR扩增中采用强耐受性DNA聚合酶；所述PCR扩增中探针Tm值不超过60℃。

【技术特征摘要】
1.一种口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：口腔拭子粗处理，制得稀释后的样品—PCR扩增—SNP分型鉴定；所述PCR扩增中采用强耐受性DNA聚合酶；所述PCR扩增中探针Tm值不超过60℃。2.根据权利要求1所述的口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，其特征在于，所述口腔拭子粗处理的方法为向口腔拭子保存管中加入200μl细胞裂解液后室温裂解10min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，12,000×g，离心10min，吸取上清液至96孔板中；所述稀释是指用蒸馏水将细胞液稀释5倍制得稀释后的样品。3.根据权利要求1所述的口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，其特征在于，所述强耐受性DNA聚合酶选自上述中的一种。4.根据权利要求1所述的口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，其特征在于，所述PCR体系如下：5.根据权利要求4所述的口腔拭子直接PCR进行SNP分型的方法，其特征在于，所述探针和引物包括4个SNP位点的探针和引物，具体如下：SNP位点1：上游引物：AAAAGAAAACTGAGTGGGAGCAGTA下游引物：TGCCCCAGCCTCTGCTT探针1：TAGTATGGAAGAAATC探针2：TAGTAGTATGGCAGAAATSNP位点2：上游引物：TTAAAATGTGGTGGATGCACTGT下游引物：CTGTCATGCACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘书杰，肖哲，焦少灼，戚珠云，宫夏霓，
申请(专利权)人：美因健康科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11