一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法技术

本发明专利技术给出一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法，其包括步骤1，收集不同产地的党参并编号，提取不同产地党参的DNA并进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；根据琼脂糖凝胶电泳结果，以党参编号为横坐标、DNA片段长度大小为纵坐标，在每一横、纵坐标相交处记录不同产地党参DNA扩增条带的检测结果，有DNA扩增条带的进行标记，无DNA扩增条带的不做标记，得到不同产地党参ISSR指纹图谱；步骤2，将待测党参的ISSR指纹图谱与不同产地党参ISSR指纹图谱进行比对，根据比对结果判别待测党参的产地。本发明专利技术可方便快捷地鉴定外表差异小易混淆的党参药材，且在党参苗期即可进行快速准确的鉴定，对保证药材基源的准确性和可靠性具有重要意义。

A method for identification of germplasm resources of Codonopsis pilosula by ISSR fingerprinting

The invention provides a method to identify the germplasm resources of Codonopsis pilosula by ISSR fingerprint, which includes step 1, collecting Codonopsis pilosula and numbering different habitats, extracting DNA of Codonopsis pilosula from different habitats and PCR amplification, using agarose gel electrophoresis to detect the amplified products; according to agarose gel electrophoresis results, Codonopsis is numbered as horizontal coordinates. The length and size of DNA fragment is a longitudinal coordinate, and the detection results of DNA amplification strip of Codonopsis pilosula from different producing areas are recorded at the intersection of each horizontal and longitudinal coordinate. The DNA amplification strip is marked, no DNA amplification strip is not marked, and the ISSR fingerprint of Codonopsis pilosula from different origin is obtained. Step 2, the ISSR fingerprint of Codonopsis pilosula and the difference of the PCR fingerprints will be measured and different. The ISSR fingerprint of Codonopsis pilosula was compared, and the origin of Dangshen was determined according to the comparison results. The invention can easily and quickly identify Codonopsis pilosula with small and easily confused appearance, and can be quickly and accurately identified in the seedling stage of Codonopsis pilosula, which is of great significance to ensure the accuracy and reliability of the base source of the medicinal materials.

【技术实现步骤摘要】
一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法
本专利技术属于中药材质量检测
，涉及一种鉴别党参产地的方法，具体涉及一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法。
技术介绍
党参是桔梗科党参属党参(Codonopsispilosula(Franch.)Nannf)、素花党参(C.pilosulaNannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen)或川党参(C.tangshenOliv.)的干燥根，是我国常用的药食两用中药，具有健脾益肺，养血生津的功效。受经济利益的驱使和物种鉴别水平的限制，目前党参药材的地方习用品较多，不同品种价值存在一定差异。党参同属近缘植物地上部分外观相似，所含有效成分种类相似，但不同产地的党参品质含量存在较大差异。利用传统的鉴别方法可将党参及其近缘品种加以区分，但这种鉴别方法主要依靠丰富的经验，同时也存在一定的主观性。此外，已有学者利用AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片段长度多态性)标记对不同种源的党参进行品种鉴定及亲缘关系分析，但是AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片段长度多态性)标记操作步骤过于复杂，且比较耗时，鉴定成本相对较高，制约了快速鉴定方面的研究。还有，近年来兴起的中药材条形码技术对于种内鉴定能力有限，扩增的序列还需要进行克隆测序，耗时费力，成本较高。简单重复序列区间(inter-simplesequencerepeat，ISSR)是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等人于1994年提出的一种分子标记技术。ISSR是基于植物基因组中广泛存在的SSR特点，利用植物基因组常见的SSR设计引物，引物长度通常为15～24个碱基长，无需预知待扩增片段的序列信息。SSR在真核生物中分布较广，且具有进化变异速度快的特点，因此ISSR-PCR可以用于检测基因组的多个变异位点。ISSR标记相比RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)和RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA标记)具有更好的稳定性和重复性，并且ISSR标记操作流程快捷简单，易上手、成本低廉，因此已广泛应用于种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传作图以及系统进化等研究领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决药用植物的现有鉴定方法成本高、操作步骤复杂、耗时长等技术问题。根据专利技术人的文献调研结果，国内外尚无利用ISSR鉴定不同产区党参植物的报道。为了鉴别不同产区党参植物，本专利技术提供一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法。本专利技术所述方法通过构建不同产区党参的分子标记指纹图谱，以实现不同产地党参植物鉴定的准确性和高效性。为了达到上述目的，本专利技术采取如下的技术方案。一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤1，收集不同产地的党参并编号，分别提取所述不同产地党参的DNA，对所得DNA进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶电泳检测所得扩增产物；根据琼脂糖凝胶电泳结果，以党参编号为横坐标、DNA片段长度大小为纵坐标，在每一横、纵坐标相交处记录不同产地党参DNA扩增条带的检测结果，有DNA扩增条带的进行标记，无DNA扩增条带的不做标记，得到不同产地党参ISSR指纹图谱；步骤2，采用步骤1所述不同产地党参ISSR指纹图谱的构建方法获得待测党参的ISSR指纹图谱，将所述待测党参的ISSR指纹图谱与所述不同产地党参ISSR指纹图谱进行比对，根据比对结果判别待测党参的产地。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述党参DNA进行PCR扩增的引物选用UBC841、UBC843、UBC844中的一种或其组合。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述PCR扩增体系为：在20μl反应体系中，模板DNA为30ng，引物浓度为0.675μΜ，TaqMasterMix10μl，加ddH2O补齐体积至20μl。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，随后进行30～40个循环(94℃变性30s，50℃～60℃退火1min，72℃延伸25s～45s)，循环结束后于72℃延伸10min，所得扩增产物4℃保存。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述琼脂糖凝胶电泳电压为140v，电泳时间30min，琼脂糖凝胶浓度1％。作为本专利技术所述技术方案的优选实施方式之一，所述提取的党参DNA为党参植物的总DNA。进一步地，所述党参DNA提取自党参植物幼苗或萌发的党参种子。本专利技术所述利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法，至少具有下述的有益效果是或优点。1)本专利技术采用ISSR分子标记技术构建党参植物的指纹图谱，在党参苗期或种子萌发期即可进行鉴定，对于保证药材基源的准确和稳定具有重要的意义。相比于传统的化学色谱指纹图技术，本专利技术所述方法具有取样少、取样时间不受限制、不受外界环境干扰等优点；此外，与序列克隆测序鉴定法相比，本专利技术所述方法操作环节少，简单且易于实施，仅需要进行党参DNA的提取，ISSR-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测即可获得准确可靠的鉴定图谱，省时省钱省力。2)本专利技术采用了2×TaqMasterMix的PCR预混液，替代了传统的Mg2+、Taq酶、dNTPs等成分，极大的减少了工作量，缩短了配制PCR反应体系所用的时间，减少了实验的误差。3)本专利技术对ISSR-PCR的反应体系、PCR的扩增程序及琼脂糖电泳参数等均进行了优化，使结果更加稳定可靠。4)利用本专利技术构建的党参ISSR指纹图谱，可以根据需要不断添加和更新其他产区的党参品种，以满足更多的产地鉴别需求。5)本专利技术构建的党参ISSR指纹图谱为实现党参种质资源鉴定的标准化和自动化奠定了基础。附图说明图1是所述三个引物UBC844、UBC843、UBC841对7个产地党参的ISSR扩增图谱。具体实施方式实施例1本实施例公开了一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法。本研究领域的技术人员可以参考本实施例的描述，或以本实施例所述方法为依据进行技术手段(比如试验参数等)的替换或适当变更与组合，以更优选的方式实现本专利技术。本实施例提供的利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法，包括党参植物资源的获取、DNA制备、ISSR-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测等操作步骤。关于党参植物资源的获取，通常采用两种方式，一是对不同产地的党参进行整株移植；一是采集不同产地党参植物的种子进行种植。本实施例采取种植不同产地党参植物种子，以党参植物幼苗作为DNA制备的对象。(1)党参幼苗种植采集甘肃、山西、重庆及湖北恩施等7个产地的党参植物种子，将采集的党参种子播种于铺满营养土的花盆中，清水浇透后至于光照培养箱培养，光照/黑暗各12h，温度25℃，待党参幼苗出土后开始，每隔3天浇灌营养液，待党参植物幼苗长出真叶(约播种后45d)开始取样。(2)党参DNA制备取党参幼苗的叶片，液氮速冻后于-80℃冰箱保存，用于党参DNA的制备。党参基因组DNA的制备可以采用本领域常规的CTAB法进行，也可采用常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤1，收集不同产地的党参并编号，分别提取所述不同产地党参的DNA，对所得DNA进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶电泳检测所得扩增产物；根据琼脂糖凝胶电泳结果，以党参编号为横坐标、DNA片段长度大小为纵坐标，在每一横、纵坐标相交处记录不同产地党参DNA扩增条带的检测结果，有DNA扩增条带的进行标记，无DNA扩增条带的不做标记，得到不同产地党参ISSR指纹图谱；步骤2，采用步骤1所述不同产地党参ISSR指纹图谱的构建方法获得待测党参的ISSR指纹图谱，将所述待测党参的ISSR指纹图谱与所述不同产地党参ISSR指纹图谱进行比对，根据比对结果判别待测党参的产地。

【技术特征摘要】
1.一种利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤1，收集不同产地的党参并编号，分别提取所述不同产地党参的DNA，对所得DNA进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶电泳检测所得扩增产物；根据琼脂糖凝胶电泳结果，以党参编号为横坐标、DNA片段长度大小为纵坐标，在每一横、纵坐标相交处记录不同产地党参DNA扩增条带的检测结果，有DNA扩增条带的进行标记，无DNA扩增条带的不做标记，得到不同产地党参ISSR指纹图谱；步骤2，采用步骤1所述不同产地党参ISSR指纹图谱的构建方法获得待测党参的ISSR指纹图谱，将所述待测党参的ISSR指纹图谱与所述不同产地党参ISSR指纹图谱进行比对，根据比对结果判别待测党参的产地。2.根据权利要求1所述利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质资源的方法，其特征在于，所述党参DNA进行PCR扩增的引物选用UBC841、UBC843、UBC844中的一种或其组合。3.根据权利要求2所述利用ISSR指纹图谱鉴定党参种质...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢超，张美德，何银生，艾伦强，刘海华，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院中药材研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42