西红花色香味多组分定量结合指纹图谱质量评价方法技术

本申请公开了一种西红花色香味多组分定量结合指纹图谱质量评价方法，本发明专利技术首先采用HPLC‑DAD‑ESI‑MSn技术对西红花中色、香、味的代表成分西红花苷、藏花醛和苦藏花素等化学成分进行分析和鉴别，鉴定了7种西红花苷类、苦藏花素、苦藏花素的苷元(HTTC)、藏花醛和2种山奈酚为苷元的黄酮类成分。在基于西红花中“色香味”多药效组分和质谱鉴定的基础上，利用波长切换HPLC‑DAD技术通过色香味多组分定量结合指纹图谱，构建了西红花的多组分质量评价方法，可对西红花进行较全面的质量分析，提高西红花临床应用的安全性和有效性。

Saffron aroma multi-component quantitative evaluation combined with the quality of the fingerprint method

The invention discloses a saffron aroma multicomponent quantitative evaluation of the quality of fingerprint method, the invention firstly uses the HPLC DAD ESI MSn of saffron color, smell and taste of the ingredients on behalf of crocin, picrocrocin and safranal and other chemical constituents were analyzed and identified, and identified 7 a class of aglycone crocin, picrocrocin, picrocrocin (HTTC), the flavonoids safranal and 2 kaempferol glycoside. Based on the saffron \flavor\ more active components and mass spectrometry, using HPLC DAD wavelength switching technology through the color and flavor of multicomponent quantitative fingerprint, construct multi component quality evaluation method of saffron, the quality can be analyzed comprehensively to improve the safety and efficiency of saffron the clinical application of saffron.

【技术实现步骤摘要】
西红花色香味多组分定量结合指纹图谱质量评价方法
本专利技术涉及中药活性成分分析
，具体地说，是涉及一种西红花色香味多组分定量结合指纹图谱质量评价方法。
技术介绍
西红花(CrocussativusL.)又称藏红花，以雌蕊上部三根红色柱头入药，具有独特的颜色、香气和苦味，价格昂贵，为名贵中药，也是世界上最名贵香料，目前从西红花中分离得到的化合物已达到50余种，主要可分为二萜类(以西红花苷类化合物为代表，为西红花红色的主要成分)、单萜类(以苦藏花素和藏花醛为代表，分别是西红花的苦味和香气成分)、黄酮类(以山奈酚为苷元)，其中西红花苷中的西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦藏花素含量较高，三者之和可占干重的40％以上，其它化合物的质量比例都较小。作为食品添加剂的国际标准ISO3632-2(2010版)，用分光光度法分别于λmax440nm、λmax330nm和λmax257nm测定西红花水提取液中色、香、味的代表成分西红花苷、藏花醛和苦藏花素的色价来进行质量控制与分级。规定西红花苷色价大于190，苦藏花素色价大于70，藏花醛色价介于20-50之间为一级品。但该方法专属性不强，不能精确表示色、香、味三类组分的含量，如西红花苷类，在257nm和330nm处也有吸收，存在干扰。2015年版《中国药典》用HPLC法测定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量，规定两者总含量大于10％为合格品，该标准只对西红花苷中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ进行含量控制，对其他西红花苷、苦藏花素、藏花醛等则没有规定。苦藏花素和藏花醛均具有较强的药理活性，为西红花的药效成分，并且苦藏花素在西红花中含量均较高，苦藏花素纳入西红花质量控制指标能更有效地控制和评价西红花药材的质量。定量指纹图谱技术是以指纹图谱与多成分定量相结合的综合评价方法，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，且能够同时进行多种药效成分的定量分析，进而可以对药品质量进行整体描述和评价，体现出中药的整体观。文献报道，不同产地，不同质量等级的西红花所含化学成分的种类与数量有较大的差异，使用定量指纹图谱技术更能全面反映西红花药材质量，为临床安全、合理用药提供依据。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种测定西红花提取液中色、香、味的代表成分西红花苷、藏花醛和苦藏花素等多组份含量；对其他复杂成分利用指纹图谱进行质量控制的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种西红花色香味多组分定量结合指纹图谱质量评价方法，包括步骤：a.确定高效液相色谱条件；b.确定质谱条件；c.制备供试品溶液；d.制备色味混合对照品和藏花醛对照品溶液；e.取对照品和西红花样品溶液进样分析，得对照品和西红花样品高效液相色谱图和质谱总离子流色谱图，首先基于液相色谱的在线紫外图谱判断化合物的结构类型，再利用波峰在正负离子模式下离子裂解规律推断化合物的结构；f.光谱和质谱分析西红花中的色谱峰特征；g.建立西红花定量指纹图谱方法：精密度试验：取同一供试品溶液按指纹图谱的色谱条件，连续进样6次，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算其相似度；稳定性试验：取同一供试品溶液，在步骤b中的色谱条件下分别在0、2、4、8、12、20、24h测定，记录色谱图，测定样品稳定性；重复性试验：取西红花样品6份，精密称定，按照步骤c中的方法制备供试品溶液，按照步骤a中的液相色谱条件下进行测定，记录色谱图，考察实验方法的重复性；h.西红花样品波长切换HPLC指纹图谱的建立和定量：取干品西红花，按步骤供试品溶液制备方法和检测方法进行检测，得到样品的高效液相色谱图，将西红花样品的高效液相色谱图谱信号数据导入国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行处理，设定第一个样品为参照图谱，选取时间窗宽度为0.1min，对照图谱的生成方法为中位数，选择稳定性和重复性在0.999以上、吸收较强、特征明显的色谱峰为共有特征峰，进行多点校正，自动匹配，生成对照图谱，11个共有色谱峰为：苦藏花素、槐糖苷、trans-5-tG、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、trans-2-G、藏花醛、西红花苷-Ⅰ的顺式异构体、西红花苷-Ⅱ的顺式异构体以及trans-1-g；然后进行各样品的相似度评价，以供试品溶液指纹图谱中西红花苷-Ⅰ的保留时间及峰面积来计算其他共有峰相对保留时间和相对峰面积，并统计结果。优选地：所述步骤a中，高效液相色谱条件：UltimateXBC18色谱柱；柱温：30℃；流动相：0.4％甲酸-甲醇，梯度洗脱，0-60min，甲醇浓度：20％-100％；DAD波长范围200～600nm，检测时间在25min内测定波长为260nm，25-29min之间测定波长为440nm，29-36min之间测定波长为260nm，36-40.5min之间测定波长为440nm，40.5-42.5min之间测定波长为310nm，42.5-60min之间测定波长为440nm；流速：0.8ml·min-1；进样量：10μl。优选地：所述步骤b中，所述质谱条件进一步为，离子源：大气压电喷雾离子源ESI；检测模式：正负离子；全扫描质核比：50-1200m/z；干燥气温度：350℃，干燥气流量：12.0L·min-1，雾化气压力：35.0psi；毛细管电压：4.5kV；碰撞电压1.0V；进入质谱的流动相流速分流至0.4ml·min-1。优选地，所述步骤c，进一步为，称取西红花样品粉末10mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加甲醇20ml，冰浴超声处理30min，放置室温，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液。优选地，其特征在于，所述步骤d，进一步为，1)制备色味混合对照品溶液：精密称取西红花苷-Ⅰ对照品、西红花苷-Ⅱ对照品、以及苦藏花素置于棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。得浓度为59.6μg·mL-1、29.6μg·mL-1和40.8μg·mL-1的西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦藏花素混合对照品溶液，摇匀，备用；2)制备藏花醛对照品溶液：精密吸取藏花醛对照品51.5mg，置25mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为2.06mg·mL-1对照品溶液，作为储备液。从中精密吸取0.5mL，置25mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得浓度为41.2μg·mL-1对照品溶液。优选地，其特征在于，所述步骤e中，进一步为，采用波长切换方法在440nm、250nm和330nm下测定西红花中的西红花苷、苦藏花素和藏花醛化合物，得对照品和西红花样品高效液相色谱图和质谱总离子流色谱图。西红花的国际标准ISO3632-2，用分光光度法测定西红花的色价来进行质量控制与分级，该方法专属性不强，不能精确表示色、香、味三类组分的含量。《中国药典》用HPLC法测定，但该标准只对西红花苷中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ进行含量控制，对其他药效成分如苦藏花素、藏花醛等则没有规定。本专利技术首先采用HPLC-DAD-ESI-MSn技术对西红花中主要化学成分进行分析和鉴别，在基于西红花中“色香味”多药效组分和质谱鉴定的基础上，利用波长切换HPLC-DAD技术通过色-香-味多组分定量结合指纹图谱，构建了西红花的多组分质量评价体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种西红花色香味多组分定量结合指纹图谱质量评价方法，其特征在于，包括步骤：a.确定高效液相色谱条件；b.确定质谱条件；c.制备供试品溶液；d.制备色味混合对照品和藏花醛对照品溶液；e.取对照品和西红花样品溶液进样分析，得对照品和西红花样品高效液相色谱图和质谱总离子流色谱图，首先基于液相色谱的在线紫外图谱判断化合物的结构类型，再利用波峰在正负离子模式下离子裂解规律推断化合物的结构；f.光谱和质谱分析西红花中的色谱峰特征；g.建立西红花定量指纹图谱方法：精密度试验：取同一供试品溶液按指纹图谱的色谱条件，连续进样6次，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算其相似度；稳定性试验：取同一供试品溶液，在步骤b中的色谱条件下分别在0、2、4、8、12、20、24h测定，记录色谱图，测定样品稳定性；重复性试验：取西红花样品6份，精密称定，按照步骤c中的方法制备供试品溶液，按照步骤a中的液相色谱条件下进行测定，记录色谱图，考察实验方法的重复性；h.西红花样品波长切换HPLC指纹图谱的建立和定量：取干品西红花，按步骤供试品溶液制备方法和检测方法进行检测，得到样品的高效液相色谱图，将西红花样品的高效液相色谱图谱信号数据导入国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行处理，设定第一个样品为参照图谱，选取时间窗宽度为0.1min，对照图谱的生成方法为中位数，选择稳定性和重复性在0.999以上、吸收较强、特征明显的色谱峰为共有特征峰，进行多点校正，自动匹配，生成对照图谱，11个共有色谱峰为：苦藏花素、槐糖苷、trans‑5‑tG、西红花苷‑Ⅰ、西红花苷‑Ⅱ、trans‑2‑G、藏花醛、西红花苷‑Ⅰ的顺式异构体、西红花苷‑Ⅱ的顺式异构体以及trans‑1‑g；然后进行各样品的相似度评价，以供试品溶液指纹图谱中西红花苷‑Ⅰ的保留时间及峰面积来计算其他共有峰相对保留时间和相对峰面积，并统计结果。...

【技术特征摘要】
1.一种西红花色香味多组分定量结合指纹图谱质量评价方法，其特征在于，包括步骤：a.确定高效液相色谱条件；b.确定质谱条件；c.制备供试品溶液；d.制备色味混合对照品和藏花醛对照品溶液；e.取对照品和西红花样品溶液进样分析，得对照品和西红花样品高效液相色谱图和质谱总离子流色谱图，首先基于液相色谱的在线紫外图谱判断化合物的结构类型，再利用波峰在正负离子模式下离子裂解规律推断化合物的结构；f.光谱和质谱分析西红花中的色谱峰特征；g.建立西红花定量指纹图谱方法：精密度试验：取同一供试品溶液按指纹图谱的色谱条件，连续进样6次，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算其相似度；稳定性试验：取同一供试品溶液，在步骤b中的色谱条件下分别在0、2、4、8、12、20、24h测定，记录色谱图，测定样品稳定性；重复性试验：取西红花样品6份，精密称定，按照步骤c中的方法制备供试品溶液，按照步骤a中的液相色谱条件下进行测定，记录色谱图，考察实验方法的重复性；h.西红花样品波长切换HPLC指纹图谱的建立和定量：取干品西红花，按步骤供试品溶液制备方法和检测方法进行检测，得到样品的高效液相色谱图，将西红花样品的高效液相色谱图谱信号数据导入国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行处理，设定第一个样品为参照图谱，选取时间窗宽度为0.1min，对照图谱的生成方法为中位数，选择稳定性和重复性在0.999以上、吸收较强、特征明显的色谱峰为共有特征峰，进行多点校正，自动匹配，生成对照图谱，11个共有色谱峰为：苦藏花素、槐糖苷、trans-5-tG、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、trans-2-G、藏花醛、西红花苷-Ⅰ的顺式异构体、西红花苷-Ⅱ的顺式异构体以及trans-1-g；然后进行各样品的相似度评价，以供试品溶液指纹图谱中西红花苷-Ⅰ的保留时间及峰面积来计算其他共有峰相对保留时间和相对峰面积，并统计结果。2.如权利要求1所述的西红花色香味多组分定量结合指纹图谱质量评价方法，其特征在于：所述步骤a中，高效液相色谱条件：UltimateXBC18色谱柱；柱温：30℃；流动相：0.4％甲酸-甲醇，梯度洗脱，0-60min，甲醇浓度：20％-100％；DAD波长范围200～600...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱晓东，周桂芬，姚冲，袁玉梅，李丽琴，余静芬，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33