一种香加皮的指纹图谱及其质量检测方法技术

本发明专利技术涉及一种香加皮的有效成分测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：称取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇制得混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液；(3)测定法：吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中相应成分的含量。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种中药的检测方法，特别涉及一种中药香加皮的指纹图谱的建立及有关成分的含量测定方法
技术介绍
：香加皮为萝摩科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮，辛、苦，温；有毒。归肝、肾、心经。具有利水消肿，祛风湿，强筋骨之功效，目前临床上也常用于治疗慢性心衰。香加皮原植物杠柳为野生，未有规范种植基地，药材质量很难控制，其中所含强心苷类物质(杠柳毒苷等)既为有效成分，又为有毒成分，临床应用中亦常出现中毒现象。2010版《中国药典》只对4-甲氧基水杨醛进行了含量测定，指标单一，难以控制香加皮的整体质量。但香加皮在应用中存在着混用严重，误用、过量或长期服用均易产生中毒现象，存在安全隐患。毒性未受重视。香加皮具有多种药理作用，近年来，香加皮作为传统中药常用于治疗慢性充血性心衰，但在用药中常见不良反应和致死性病例的报道，这与其自身毒性有关。2010版中国药典中虽注明香加皮有毒，但其含量测定项下只有4-甲氧基水杨醛一个指标，此成分是香加皮的主要香气成分，无法代表香加皮的药效和毒性，因此不能对香加皮的质量进行有效控制。近年来，香加皮作为传统中药治疗慢性充血性心衰有其独特优势，目前应用也越来越多，但强心苷安全窗小，药材含量波动大，作用强，一直以来频有中毒现象发生。香加皮的安全监管势在必行。有毒成分波动大。香加皮原植物杠柳多生于山野、河边、砂质地，采收期为春、秋两季，主产地为山东、山西、河北、河南4省，其中以山西、河南产量最大，此外四川、甘肃、湖南、辽宁、吉林、江苏等地亦有产。产地分布范围大，采收期也有春、秋之别，使得香加皮药材中各成分差异大，质量波动不稳定。近年来，关于香加皮质控的文献有：同时测定4-甲氧基水杨醛和杠柳毒苷，同时测定4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷和异香草醛。同时测定香加皮中以4-甲氧基水杨醛、绿原酸和杠柳毒苷的含量未报道过。目前对于指纹图谱的研究仅有李丹毅进行了香加皮HPLC指纹图谱研究，针对香加皮化学成分、质量标准等方面的研究多为单一成分为指标的含量测定分析，李丹毅等开展了香加皮指纹图谱的研究，但所建立的HPLC指纹图谱检测时间为80分钟，分析耗时长，损耗试剂多，不利于进行多批次样本的分析。因此，急需建立一种检测更加全面、更快速的香加皮质量评价方法。
技术实现思路
：本专利技术提供一种香加皮有效成分的测定方法、超高液相指纹图谱的建立方法以及采用此方法得到的超高效液相标准对照指纹图谱。根据本专利技术所提供的香加皮的有效成分测定方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备称取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇制得混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液；(3)测定法：吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中相应成分的含量。其中，超高效液相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱选自：C18色谱柱，流动相：0.1％-1％磷酸水溶液-甲醇流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为0.1-0.5mL/min，柱温30-40℃，检测波长：220-230nm。根据本专利技术的测定方法，步骤(1)中混合对照品溶液中绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷的浓度范围分别为0.332mg·L-1-33.2mg·L-1、1.61mg·L-1-161.1mg·L-1、0.968mg·L-1-96.8mg·L-1。本专利技术最优选的对照品溶液的制备方法为：分别取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品适量，精密称定，甲醇溶解，摇匀，制成质量浓度分别为33.2mg·L-1、161.1mg·L-1、96.80mg·L-1的混合对照品贮备液，存贮于4℃冰箱中备用。精密量取混合对照品贮备溶液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为含量测定用混合对照溶液，绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷质量浓度分别为16.62mg·L-1、8.05mg·L-1、4.84mg·L-1，存贮于4℃冰箱中备用。根据本专利技术，流动相为0.1％磷酸水溶液-甲醇，梯度程序如下：根据本专利技术的实施方式之一，梯度程序优选为：0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。根据本专利技术的另一实施方式，梯度程序可以为：根据本专利技术的测定方法，所述步骤(3)中溶液的进样量可以为0.5-2μL。根据本专利技术，最优选的色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相0.1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱：0～3min,10％～25％B；3～8min,25％～37％B；8～11.5min,37％～45％B；11.5～13min,45％～57％B；13～19min,57％～90％B；19～20min,90％B。流速0.3mL·min-1；检测波长220nm；柱温35℃；进样量1μL。3种成分的理论塔板数均不低于6000，此色谱条件检测时间短，信息量丰富，亦用于指纹图谱的分析，对照品及样品图谱见附图1。根据本专利技术的测定方法，所述步骤(2)中提取方法可以为超声提取、回流提取或索氏提取。根据本专利技术所提供的方法，步骤(2)中香加皮的称样量为0.125g-1.000g。根据本专利技术，最优选的供试品溶液的制备方法为：样品干燥粉碎，分别取各样品粉末(过三号筛)0.25g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入30％甲醇溶液20mL，超声提取40min(功率500W，频率40kHz，水温在25℃以下)，放冷，30％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，取适量至离心管中，于15000r·min-1下高速离心10min，取上清液，即得。供试品的提取时间会影响最终图谱的出峰情况，40min的出峰个数最多，信息丰富，而提取时间低于10min则提取不完全。因此，在步骤(2)中最优选的提取时间为40min。根据本专利技术的测定方法，采用该方法得到的指纹图谱相对保留时间为：本专利技术的另一目的是提供一种香加皮超高液相指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备分别取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇溶解制成质量浓度分别为0.332mg·L-1-33.2mg·L-1、1.61mg·L-1-161.1mg·L-1、0.968mg·L-1-96.8mg·L-1的混合对照品贮备液。(2)供试品溶液的制备取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入30％甲醇溶液，采用超声提取、回流提取或者索氏提取40min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液。(3)获得色谱图以对照品溶液作为参照物，将供试品溶液和对照品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，其中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱选自：C18色谱柱，流动相：0.1％磷酸水溶液-甲醇流动相，进行梯度洗脱。梯度程序为0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香加皮的有效成分测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备称取绿原酸、4‑甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇制得混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入甲醇溶液，提取20‑50min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液；(3)测定法：吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中相应成分的含量；其中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱选自：C18色谱柱，流动相：0.1％‑1％磷酸水溶液‑甲醇流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为0.1‑0.5mL/min，柱温30‑40℃，检测波长：220‑230nm。

【技术特征摘要】
1.一种香加皮的有效成分测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备称取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇制得混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液；(3)测定法：吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中相应成分的含量；其中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱选自：C18色谱柱，流动相：0.1％-1％磷酸水溶液-甲醇流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为0.1-0.5mL/min，柱温30-40℃，检测波长：220-230nm。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中，步骤(1)中混合对照品溶液中绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷的浓度范围分别为0.332mg·L-1-33.2mg·L-1、1.61mg·L-1-161.1mg·L-1、0.968mg·L-1-96.8mg·L-1。3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，流动相为0.1％磷酸水溶液-甲醇，梯度程序如下：4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，梯度程序如下：0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，梯度程序如下：6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中，溶液的进样量为0.5-2μL。7.根据权利要求1所述的测定方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：鄂秀辉，李丽，何毅，宋兆辉，
申请(专利权)人：天士力制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12