一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法技术

本发明专利技术是检测人HLA‑B*5801等位基因的方法，包括：1)设计序列特异性引物查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的检测位点设计筛选合适的引物对，并根据不同位点，组合成不同的PCR反应体系；2)提取人外周血细胞样本的基因组DNA，利用筛选出的引物进行扩增；3)对扩增的PCR产物进行SAP处理，进行单碱基延伸反应，纯化后得样品分析物；4)将样品分析物点样至芯片基质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，获得样品分子量，检出等位基因对应位点信息，完成基因分型分析。本发明专利技术的优点：一张芯片可对384个样本进行多重检测，每个体系最多可实现30重反应，同时检测多个HLA‑B*5801等位基因位点。

A method for detecting human HLA-B*5801 allele

The present invention is a method to detect the human HLA B*5801 allele, including: 1) design sequence specific primers to find the DNA sequence of the target gene, select the appropriate primer pairs for the detection loci of the target gene, and combine the different PCR reaction system according to the different loci, and 2) extract the genomic D of the human peripheral blood cell samples. NA, amplification of the selected primers; 3) SAP treatment of the amplified PCR products, single base extension reaction, purified sample analyte, 4) the sample analyte sample to the chip matrix, the matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry was used to analyze the molecular weight of the sample and detect the allele. The information of the corresponding loci was used to complete the genotyping analysis. The advantage of the invention is that a single chip can be used for multiple detection of 384 samples, each of which can achieve a maximum of 30 reacts and detect multiple HLA allele loci.

【技术实现步骤摘要】
一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法
本专利技术涉及的是一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法，具体涉及一种检测人HLA-B*5801基因的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法，属于药物基因组学和基因诊断领域。
技术介绍
人类白细胞抗原(HLA)是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体，全世界已发现接近3000种等位基因，其中多数等位基因十分罕见。该基因是目前为止人类最复杂的遗传多态性系统，其多态性分布存在明显的族群特征。对来自不同国家和地区的汉族人的研究表明，HLA-B*5801基因与药物别嘌醇导致的严重皮肤不良反应存在着很强的相关性。非汉族人群中，则该药物与其相关性非常低。痛风是嘌呤代谢异常致使尿酸合成增加而导致的代谢性疾病。痛风与人体的代谢失衡有关，与血尿酸水平升高关系密切。在我国，别嘌醇被作为首选治疗痛风的药物。但是别嘌醇的使用会出现一定的药物不良反应。近年来，许多研究显示，该药物引起的严重药疹与HLA-B*5801基因密切相关。目前中国台湾地区在服用别嘌醇前必须进行HLA-B*5801基因检测。美国风湿病学会痛风治疗指南中也强调，发生别嘌醇相关的严重过敏性药疹危险性增高，在使用别嘌醇前，应该进行HLA-B*5801基因检测。因此，在服用抗痛风药物之前，进行HLA-B*5801基因检测，实现了个体化用药。目前，国内外对HLA-B*5801等位基因进行检测的方法主要有DNA直接测序法和Taqman探针法等，DNA直接测序法是目前等位基因检测的金标准，但存在费时费力等缺陷，是一种低通量的检测方法，不适用于大量样本检测；Taqman是高度特异的定量PCR技术，其特点是适应于大样本少量等位基因的位点检测，是一种中等通量的等位基因检测，而对于同时检测多个等位基因的位点，则费用较高，并不适合使用。
技术实现思路
本专利技术提出的是一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法，其目的旨在克服现有技术存在的上述缺陷，基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOFMS)方法检测人HLA-B*5801等位基因，实现高效、灵敏、准确的同时检测人HLA-B*5801等位基因中的多个位点，同时适应于大样本或小样本，为协助别嘌醇的临床个体化给药、保证用药的安全和有效提供技术支撑。本专利技术的技术解决方案：一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法，该方法包括以下步骤：1)设计序列特异性引物查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的检测位点设计筛选合适的引物对，并根据不同的位点，组合成不同的PCR反应体系；2)提取人外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤1)筛选出的引物进行扩增；3)对扩增的PCR产物进行SAP处理，进行单碱基延伸反应，纯化后得样品分析物；4)将样品分析物点样至芯片基质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，获得样品的分子量，检出等位基因对应的位点信息，完成基因分型分析。优选的，所述的步骤1)，包括以下步骤：(1)标注每孔对应的DNA样品的编号及所用反应体系和引物；(2)在反应孔中分别加入1μlDNA模板，贴膜，2000rpm离心10秒后备用；(3)按下表配制PCR反应液：(4)将PCR反应液4μl，加入已有1μlDNA的反应孔板中，使各孔终体积为5μl；(5)将每孔装有5μl反应液的孔板2000rpm离心30秒后放入PCR仪，进行基因片段扩增反应程序，该PCR反应程序为：37℃5min，95℃10min，40个循环，每循环95℃15s、60℃45s；(6)PCR反应程序结束后，将孔板2000rpm离心30秒后备用，4℃保存。优选的，所述的步骤2)中的提取外周血细胞样本的基因组DNA，包括：采用DNA提取试剂盒提取人外周血细胞样本的基因组DNA，调整DNA浓度为20-50ng/μl。优选的，所述的步骤3),包括以下步骤：(1)按下表配制SAP反应液：(2)向PCR反应孔板内加入SAP反应液，每孔加2μl，封膜、2000rpm离心30秒；(3)将已加入SAP反应液的PCR反应孔板放入PCR仪中，反应程序：37℃40min，85℃5min；(4)反应结束后将PCR反应孔板取出，2000rpm离心30秒备用，4℃保存；(5)延伸反应(a)按下表配制iPlex反应试剂：(b)将iPlex反应液加入PCR反应孔板，每孔加2μl，封膜、2000rpm离心30秒；(c)将已加入iPlex反应液的PCR反应孔板放入PCR仪中，反应程序，延伸反应条件为：94℃30sec；40个大循环，每个大循环包括94℃5sec和5个小循环，每个小循环包括55℃5sec、80℃5sec；72℃3min；(d)反应结束后，将PCR反应孔板取出，2000rpm离心30秒备用，4℃保存；(6)产物纯化(a)取树脂在树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min；(b)将反应结束的PCR反应孔板2000rpm离心1min，每孔加入25μl去离子水，倒置在树脂板上，然后将树脂板扣在孔板上，敲击使树脂落入孔板，封膜；(c)翻转孔板20min，3500rpm离心5min后备用。优选的，所述的步骤4)中采用TYPER软件分析实验结果。本专利技术的优点：操作简便、无需序列特异性探针，一张芯片可对384个样本进行多重检测，每个体系最多可实现30重反应，同时检测多个HLA-B*5801等位基因位点，通量能够实现个性化调整，从低通量高分辨率到高通量高分辨率，适用范围广，适用于几十到上千个样本，可同时检测几十到成百上千个位点；无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低于测序法和Taqman定量PCR方法；具有高灵活度，一张芯片上样本和位点检测匹配可随意选择；分析所需样本量少(20ng)，具有高灵敏度，检测精度高，SNP检测准确率可达99.99％。适合临床常规基因检测，进一步为临床个体化合理用药提供了技术支撑。附图说明图1是一个样本一个反应体系的HLA-B*5801基因检测图。图2是rs2257269位点CC/CT分型图。具体实施方式下面结合实施例和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。本专利技术采用时间飞行质谱(MALDI-TOF)方法，首先通过PCR扩增含有SNP的基因组片段，然后通过序列特异性引物实现单碱基延伸，随后样品与芯片基质共结晶后在真空管中受瞬时纳秒(10-9秒)强激光激发，核酸分子因此解吸附成为单电荷离子，由于电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息，进而判断是否含有HLA-B*5801等位基因。本方法适用于同时检测多个样本多个SNP位点。更具体的，本专利技术是一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法，对待测样品基因组DNA提取，经PCR扩增后，SAP处理、单碱基延伸后，产物纯化，用飞行时间质谱仪进行检测，进行等位基因检测。以下实施例中所用飞行质谱仪为MassARRAYCompactSystem(SEQUENOM公司)，型号PT007040。点样仪为MassArrayTMNanodispense本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人HLA‑B*5801等位基因的方法，其特征是该方法包括以下步骤：1)设计序列特异性引物查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的检测位点设计筛选合适的引物对，并根据不同的位点，组合成不同的PCR反应体系；2)提取人外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤1)筛选出的引物进行扩增；3)对扩增的PCR产物进行SAP处理，进行单碱基延伸反应，纯化后得样品分析物；4)将样品分析物点样至芯片基质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，获得样品的分子量，检出等位基因对应的位点信息，完成基因分型分析。

【技术特征摘要】
1.一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法，其特征是该方法包括以下步骤：1)设计序列特异性引物查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的检测位点设计筛选合适的引物对，并根据不同的位点，组合成不同的PCR反应体系；2)提取人外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤1)筛选出的引物进行扩增；3)对扩增的PCR产物进行SAP处理，进行单碱基延伸反应，纯化后得样品分析物；4)将样品分析物点样至芯片基质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，获得样品的分子量，检出等位基因对应的位点信息，完成基因分型分析。2.如权利要求1所述的一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法，其特征是所述的步骤1)，包括以下步骤：(1)标注每孔对应的DNA样品的编号及所用反应体系和引物；(2)在反应孔中分别加入1μlDNA模板，贴膜，2000rpm离心10秒后备用；(3)按下表配制PCR反应液：(4)将PCR反应液4μl，加入已有1μlDNA的反应孔板中，使各孔终体积为5μl；(5)将每孔装有5μl反应液的孔板2000rpm离心30秒后放入PCR仪，进行基因片段扩增反应程序，该PCR反应程序为：37℃5min，95℃10min，40个循环，每循环95℃15s、60℃45s；(6)PCR反应程序结束后，将孔板2000rpm离心30秒后备用，4℃保存。3.如权利要求1所述的一种检测人HLA-B*5801等位基因的方法，其特征是所述的步骤2)中的提取外周血细胞样本的基因组DNA，包括：采用DNA提取试剂盒提取人外周血细胞样本的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王家亮，
申请(专利权)人：江苏美因康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32