一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法，属于基因检测技术领域，相关基因多态性包括HLA‑B*1502和HLA‑B*5801基因多态性，试剂盒包括用于用于人全血样本处理的样本处理试剂、采用PCR8联管单人份预混分装的基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为基因质粒DNA和内参质粒DNA，阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。本发明专利技术为提升检测的特异性和灵敏性，采用根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和MGB‑NFQ荧光探针，进行特异扩增和实时检测分析，使检测能从HLA‑B多达几千种等位基因多态性中准确、特异、灵敏地检出目的基因变异。

A Rapid and Efficient Kit and Method for Detecting Polymorphisms of Drug-induced Dermal Adverse Reactions Related Genes

The invention discloses a kit and a method for rapid and efficient detection of gene polymorphisms related to drug-induced skin adverse reactions, belonging to the field of gene detection technology. The related gene polymorphisms include HLA_B*1502 and HLA_B*5801 gene polymorphisms, and the kit includes sample processing reagents for human whole blood sample processing and gene detection reagents for single pre-mixed subpackage using PCR-8 tube. Positive control and negative control, positive control were gene plasmid DNA and internal reference plasmid DNA, negative control was super pure water without target gene and internal reference gene. In order to enhance the specificity and sensitivity of the detection, the specific amplification primers designed according to the target gene sequence are used to carry out specific amplification and real-time detection and analysis of MGB NFQ fluorescent probes, so that the detection can accurately, specifically and sensitively detect the target gene variation from as many as thousands of allele polymorphisms of HLA B.

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法
本专利技术涉及一种基因多态性的试剂盒及方法，特别是涉及一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法，属于基因检测

技术介绍
调查研究表明，卡马西平、苯妥英等药物用于HLA-B*1502等位基因阳性亚裔患者治疗出现史蒂文斯一约翰逊综合征sJs和中毒性表皮坏死松解症TEN的严重皮肤反应的初步数据，HLA-B*1502是一种人类白细胞抗原HLA等位基因，几乎只存在于亚洲人种之中，包括中国汉族人、菲律宾人、马来西亚人、南亚印度人和泰国人。在中国、泰国、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾和中国台湾地区估计有10％-15％甚至更多的患者携带HLA-B*1502等位基因，包括印度人在内的南亚人携带该基因的比率中等，平均为2％-4％，但在一些人群中比率较高，日本人和韩国人携带此基因的比率较低，不到l％。目前，卡马西平、苯妥英等抗癫痫的药品说明书建议，可能携带HLA-B*1502等位基因的患者在接受卡马西平、苯妥英等抗癫痫卡马西平治疗之前应进行HLA-B*1502等位基因筛查，筛查结果阳性的患者不宜使用卡马西平、苯妥英等抗癫痫，除非其效益明显大于风险。HLA-B*58：01等位基因位于人类第6号染色体，是人类白细胞抗原的基因型，HLA-B*5801等位基因与别嘌呤醇引发的SJS或TEN的强相关性首先由台湾学者在汉族人群中发现，并被泰国、新加坡、香港和中国多个研究小组在汉族人群中证实，在其他人种，日本人和韩国人也被证明呈现很强的相关性，欧洲病人中SJS与HLA-B*5801呈现相对较弱的相关性。2012年美国风湿病学会更新了痛风管理指南，其中建议使用别嘌呤醇前，对严重过敏反应的高危人群，建议进行HLA-B*5801等位基因检测，该高危人群包括韩国裔、中国裔汉族和泰国裔，因此，HLA-B*5801与别嘌呤醇引发的SJS或TEN的强相关性有种族差异性，汉族人中HLA-B*5801等位基因频率为6-15％，具有地域差异。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是为了提供一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法，解决现有技术中检测HLA-B*1502和HLA-B*5801基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等问题。本专利技术的目的可以通过采用如下技术方案达到：一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒，相关基因多态性包括HLA-B*1502和HLA-B*5801基因多态性，试剂盒包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。进一步的，基因检测试剂包括：检测HLA-B*1502引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；检测HLA-B*1502特异性探针SEQIDNO.3；检测HLA-B*5801引物对SEQIDNO.4和SEQIDNO.5；检测HLA-B*5801特异性探针SEQIDNO.6；探针核酸序列5’采用FAM、TET、VIC、HEX和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB-NFQ基团修饰。进一步的，检测HLA-B*1502引物SEQIDNO.1为1502上游引物：5’-GCCGCGAGTCGAGGAT-3’；检测HLA-B*1502引物SEQIDNO.2为1502下游引物：5’-GTTGTAGTACCGCGCAGGT-3’；检测HLA-B*1502特异性探针SEQIDNO.3为1502荧光探针：5’-荧光基团-ACACACAGATCTCC-MGB-NFQ-3’；检测HLA-B*5801引物SEQIDNO.4为5801上游引物：5’-GACCCAGTTCGTGAGGTTCC-3’；检测HLA-B*5801引物SEQIDNO.5为5801下游引物：5’-AGTTCCGTGTCTCCCCGTG-3’；检测HLA-B*5801特异性探针SEQIDNO.6为5801荧光探针：5’-荧光基团-CTCCGTCCTCTGACTC-MGB-NFQ-3’。进一步的，基因检测试剂还包括用于内参的引物对SEQIDNO.7、SEQIDNO.8及内参探针SEQIDNO.9，探针采用TaqMan探针；SEQIDNO.7为内参上游引物：5’-CCTTCCTGCCACCGCTGAT-3’；SEQIDNO.8为内参下游引物：5’-TGCCTTCGCAACCATTCCCTTA-3’；内参探针SEQIDNO.9：5’-荧光基团-CGCTATGCTCCGCGCGCATCGTCTGCTC-BHQ-3’。进一步的，基因检测试剂还包括具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液TaqPathProAmpMasterMix，预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、ROX荧光校准染料、dNTP、MgCl2、PCRbuffer。进一步的，样本处理试剂用于人全血样本处理，基因检测试剂采用PCR8联管单人份预混分装。进一步的，阳性对照品为混合HLA-B*15：02、HLA-B*58：01基因质粒DNA和内参质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的方法，包括如下步骤：步骤1：样本快速处理，取EDTA抗凝全血样本，取2μL，加入20μL样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min；步骤2：将步骤1所得样本2μL，加入到18μL预混分装的基因检测试剂中，混匀后进行PCR扩增；步骤3：设置仪器反应流程和反应参数；步骤4：确定样本基因分型，若检测结果有S型扩增曲线升起，且Ct.值小于阳性判定值，则为阳性检测结果，若无曲线升起或Ct.值大于阳性判定值，判读为不含该基因型。进一步的，步骤3中，设置的仪器反应参数为：第1阶段：95℃，10min，1个循环；第2阶段：95℃，10S，40个循环；第3阶段：60℃，30S，40个循环，在第3阶段打开荧光通道收集荧光值。进一步的，阳性检测结果判定值如下：内参Ct值：≤32；检测通道Ct.值：≤32；基因型别：含被测HLA-B5801或HLA-B1502基因。本专利技术的有益技术效果：1、本专利技术提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法，为提升检测的特异性和灵敏性，采用根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和MGB-NFQ荧光探针，进行特异扩增和实时检测分析，使检测能从HLA-B多达几千种等位基因多态性中准确、特异、灵敏地检出目的基因变异。2、本专利技术提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法，检测等位基因包括HLA-B*15：02、HLA-B*58：01，本专利技术试剂盒组成包括用于样本快速处理的试剂、单管预混完成的基因检测试剂、混合被测靶基因质粒DNA的阳性对照品，不含靶基因的阴性对照品。3、本专利技术提供的快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒及方法，基因检测试剂具有较强的抗PCR抑制物能力和多重PCR功能，检测时无需gDNA提取纯化、只需将全血样本细胞快速裂解处理后即可加入单管预混的PCR反应液，不同的被测靶基因分别采用不同的引物对进行基因扩增，并采用不同的荧光染料基团标记的探针进行实时检测分析，实现一个反应体系同时对多基因变异的检出。4、本专利技术提供的快速高效检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，相关基因多态性包括HLA‑B*1502和HLA‑B*5801基因多态性，试剂盒包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。

【技术特征摘要】
1.一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，相关基因多态性包括HLA-B*1502和HLA-B*5801基因多态性，试剂盒包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。2.如权利要求1所述的一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，基因检测试剂包括：检测HLA-B*1502引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；检测HLA-B*1502特异性探针SEQIDNO.3；检测HLA-B*5801引物对SEQIDNO.4和SEQIDNO.5；检测HLA-B*5801特异性探针SEQIDNO.6；探针核酸序列5’采用FAM、JOE、VIC、NED和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB-NFQ基团修饰。3.如权利要求2所述的一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，检测HLA-B*1502引物SEQIDNO.1为1502上游引物：5’-GCCGCGAGTCGAGGAT-3’；检测HLA-B*1502引物SEQIDNO.2为1502下游引物：5’-GTTGTAGTACCGCGCAGGT-3’；检测HLA-B*1502特异性探针SEQIDNO.3为1502荧光探针：5’-荧光基团-ACACACAGATCTCC-MGB-NFQ-3’；检测HLA-B*5801引物SEQIDNO.4为5801上游引物：5’-GACCCAGTTCGTGAGGTTCC-3’；检测HLA-B*5801引物SEQIDNO.5为5801下游引物：5’-AGTTCCGTGTCTCCCCGTG-3’；检测HLA-B*5801特异性探针SEQIDNO.6为5801荧光探针：5’-荧光基团-CTCCGTCCTCTGACTC-MGB-NFQ-3’。4.如权利要求1所述的一种快速高效检测药源性皮肤不良反应相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，基因检测试剂还包括用于内参的引物对SEQIDNO.7、SEQIDNO.8及内参探针SEQIDNO.9，探针采用TaqMan探针；SEQIDNO.7为内参上游引物：5’-CCTTCCTGCCACCGCTGAT-3’；SEQIDNO.8为内参下游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：王家亮，何顺清，
申请(专利权)人：江苏美因康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32