本发明专利技术公开了一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，属于基因检测技术领域，用于检测与肿瘤化疗药物伊立替康不良反应相关基因UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性，包括用于人全血样本快速处理的样本处理试剂、经预混单人份分装的基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。本发明专利技术在保证检出特异性和灵敏的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。
【技术实现步骤摘要】
一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法
本专利技术涉及一种基因多态性检测试剂盒及方法，特别是涉及一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，属于基因检测
技术介绍
尿苷二磷酸葡萄糖醛酰转移酶(UGTs)是一大类能催化葡萄糖醛酸与亲核底物结合的膜结合酶，主要存在于肝脏和肝外组织内质网，UGT分为两个家族，已经发现有17种人类的基因编码不同序列的UGT，酶的表达具有明显的组织特异性，主要在肝脏中表达，其他组织包括脑、肾、胃肠道等，UDP-葡萄糖醛基转移酶1A1(简称UGT1A1)，参与多种物质的葡萄糖醛基化，这一结合反应的目的在于增加底物的水溶性，增加从胆汁和尿液中的排泄量，达到物质代谢、解毒的目的，UGT1A1基因有30多个等位基因，其中一些SNP可影响酶的功能和分步。伊立替康是(Irenotecan，CPT-11)是喜树碱半合成衍生物，在体内经羟酸酯酶水解成7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，SN-38是DNA拓扑异构酶I的抑制剂，作用于细胞周期S期，抑制、干扰DNA修复和转录，伊立替康自用于临床后，一直是治疗直结肠癌最有效的化疗药物之一，但在临床使用中，也发现伊立替康会导致严重的血液毒性和消化道毒性，表现为腹泻和中性粒细胞减少，发生率可达30％和50％，严重时会导致死亡。临床研究表明UGT1A1*6型和*UGT1A1*28型与伊立替康引发的副反应有着强相关性，且种族差异，在高加索患者中，UGT1A1*28纯和子(TA7/7)和杂合子(TA6/7)显著增加患者发生严重粒细胞减少和腹泻的风险，而在亚洲患者中，UGT1A1*6型突变显著增加患者发生3-4级中性粒细胞减少、血小板减少及腹泻的风险。UGT1A1*6型的多态性表现为c.211G>A。亚洲人群中，A/G和A/A携带者在伊立替康治疗中，发生3-4级中性粒细胞减少和非血液学毒性的风险显著提高，UGT1A1*6型突变在亚洲人群中的携带比例高达13-23％，UGT1A1*28多态性是指UGT1A1基因启动子区TA碱基重复序列的多态性，正常野生型为6个TA重复序列(TA6)，而*UGT1A1*28型则含7个TA重复序列(TA7)，根据TA重复序列的多少，可以分为*1/*1、*1/*28和*28/*28。UGT1A1*28纯合突变型在非洲人和高加索人中频率较高达到12-27％和5-15％，在亚洲人中，仅为1.2-5％。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是为了提供一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，解决现有技术检测UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等不足。本专利技术的目的可以通过采用如下技术方案达到：一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，用于检测与肿瘤化疗药物伊立替康不良反应相关基因UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性，包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。进一步的，基因检测试剂采用PCR8联管单人份预混分装，包括：检测UGT1A1*6型引物对：SEQIDNO.1-SEQIDNO.2；检测UGT1A1*6(211G＞A)型特异性探针SEQIDNO.3-SEQIDNO.4；检测UGT1A1*28(6TA＞7TA)型引物对：SEQIDNO.5-SEQIDNO.6；检测UGT1A1*28型特异性探针SEQIDNO.7-SEQIDNO.8；探针核酸序列5’采用FAM、JOE、VIC、NED和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB-NFQ基团修饰。进一步的，引物探针设计如下：SEQIDNO.1为UGT1A1211G＞A上游引物：5’-AGCTCCACCTTCTTATCTCTG-3’；SEQIDNO.2为UGT1A1211G＞A下游引物：5’-TTGTGCAGTAAGTGGGAACA-3’；SEQIDNO.3为UGT1A1211G荧光探针：5’-荧光基团-TAAATGCTCGTCTCT-MGB-NFQ-3’；SEQIDNO.4为UGT1A1211A荧光探针：5’-荧光基团-TAAATGCTCtGTCTCT-MGB-NFQ-3’；SEQIDNO.5为UGT1A16TA＞7TA上游引物：5’-CATTAACTTGGTGTATCGATTGGT-3’；SEQIDNO.6为UGT1A16TA＞7TA下游引物：5’-CAGCATGGGACACCACTG-3’；SEQIDNO.7为UGT1A16TA荧光探针：5’-荧光基团-TGCCATATATATATATATAGTAG-MGB-NFQ-3’；SEQIDNO.8为UGT1A17TA荧光探针：5’-荧光基团-GCCATATATATATATATATAAGTA-MGB-NFQ-3’。进一步的，基因检测试剂还包括：还包括用于内部质控的内参引物对SEQIDNO.11-SEQIDNO.12和内参探针SEQIDNO.13，探针采用TaqMan探针，5’修饰CY5荧光基团，3’采用BHQ淬灭基团修饰。进一步的，引物探针设计如下：SEQIDNO.11为内参上游引物：5’-CCTTCCTGCCACCGCTGAT-3’；SEQIDNO.12为内参下游引物：5’-TGCCTTCGCAACCATTCCCTTA-3’；SEQIDNO.13为内参探针：5’-荧光基团-CGCTATGCTCCGCGCGCATCGTCTGCTC-BHQ-3’。进一步的，基因检测试剂还包括：具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液-TaqPathProAmpMasterMix，预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、ROX荧光校准染料、dNTP、MgCl2、PCRbuffer。进一步的，阳性对照品为混合UGT1A1211G、211A、6TA、7TA基因质粒DNA和内参质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的方法，包括如下步骤：步骤1：取EDTA抗凝全血样本，取2μL，加入20μL样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min；步骤2：将步骤1所得样本2μL，分别加入到18μL预混分装的MTHFR、MTRR野生型和突变型基因检测试剂中，混匀后进行PCR扩增检测；步骤3：设置仪器反应流程和参数，检测反应；步骤4：根据同一基因位点野生型和突变型荧光通道Ct.值之差△Ct.值确定样本基因分型。进一步的，步骤3中，反应参数为：第1阶段：95℃，10min，1个循环；第2阶段：95℃，10S，40个循环；第3阶段：60℃，30S，40个循环，在第3阶段打开荧光通道收集荧光值。进一步的，步骤4中，基因分型判读结果如下：内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，△Ct.≥3，基因型别为：UGT1A1【211G/G、6TA/6TA】；内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，-3＜△Ct.＜3，基因型别为：UGT1A1【211G/A、6TA/7TA】；内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，△Ct本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，用于检测与肿瘤化疗药物伊立替康不良反应相关基因UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性，包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。
【技术特征摘要】
1.一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，用于检测与肿瘤化疗药物伊立替康不良反应相关基因UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性，包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。2.如权利要求1所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，基因检测试剂采用PCR8联管单人份预混分装，包括：检测UGT1A1*6型引物对：SEQIDNO.1-SEQIDNO.2；检测UGT1A1*6(211G＞A)型特异性探针SEQIDNO.3-SEQIDNO.4；检测UGT1A1*28(6TA＞7TA)型引物对：SEQIDNO.5-SEQIDNO.6；检测UGT1A1*28型特异性探针SEQIDNO.7-SEQIDNO.8；探针核酸序列5’采用FAM、JOE、VIC、NED和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB-NFQ基团修饰。3.如权利要求2所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，引物探针设计如下：SEQIDNO.1为UGT1A1211G＞A上游引物：5’-AGCTCCACCTTCTTATCTCTG-3’；SEQIDNO.2为UGT1A1211G＞A下游引物：5’-TTGTGCAGTAAGTGGGAACA-3’；SEQIDNO.3为UGT1A1211G荧光探针：5’-荧光基团-TAAATGCTCGTCTCT-MGB-NFQ-3’；SEQIDNO.4为UGT1A1211A荧光探针：5’-荧光基团-TAAATGCTCTGTCTCT-MGB-NFQ-3’；SEQIDNO.5为UGT1A16TA＞7TA上游引物：5’-CATTAACTTGGTGTATCGATTGGT-3’；SEQIDNO.6为UGT1A16TA＞7TA下游引物：5’-CAGCATGGGACACCACTG-3’；SEQIDNO.7为UGT1A16TA荧光探针：5’-荧光基团-TGCCATATATATATATATAGTAG-MGB-NFQ-3’；SEQIDNO.8为UGT1A17TA荧光探针：5’-荧光基团-GCCATATATATATATATATAAGTA-MGB-NFQ-3’。4.如权利要求1所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，基因检测试剂还包括：还包括用于内部质控的内参引物对SEQIDNO.11-SEQIDNO.12和内参探针SEQIDNO.13，探针采用TaqMan探针，5’修饰CY5荧光基团，3’采用BHQ淬灭基团修饰。5.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：何顺清，王家亮，杨钦予，
申请(专利权)人：江苏美因康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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