一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。本发明专利技术针对蜜蜂丝状病毒ATPase特异性靶基因设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待检测样品中是否存在蜜蜂丝状病毒的检测方法。本发明专利技术的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花4h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，比其他PCR技术具有更高的特异性。特别适合蜜蜂病原调查与疾病防控使用。

Detection primer set, detection kit and detection method for rapid detection of bee filamentous virus

The invention discloses a detection primer set, a detection kit and a detection method for rapidly detecting bee filamentous viruses. The present invention for the bee filamentous virus ATPase specific target gene screening and design a set of specific primers and the group containing the test kit agent primer set and using the kit by loop mediated isothermal amplification detection method, and then determine whether there is a bee filamentous virus detection method in the sample to be detected. The detection kit and the detection method has the advantages of high sensitivity, specificity, accuracy rate, short detection time, from sample treatment to report the results of only 4h, do not need the PCR instrument and electrophoresis instrument, simple operation process, with more specificity than other PCR technologies. The utility model is particularly suitable for the investigation of bee pathogens and the use of disease prevention and control.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
：本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
：意大利蜜蜂丝状病毒AmFV(ApismelliferaFilamentousVirus，AmFV)是其中唯一的一种dsDNA病毒，其基因组达498500bp，基因组DNA和核蛋白经折叠和环化，形成长450×170nm的杆状，根据基因组分析类似于无脊椎动物的杆状病毒。具有较广的宿主谱，包括意大利蜜蜂、中华蜜蜂，以及一些独栖蜂如熊蜂。其传播方式有水平传播和垂直传播。AmFV单独感染蜜蜂不会引起明显的病理特征，与微孢子虫共感染时会致死蜜蜂，死蜂的血淋巴呈乳白色，一般会在春季发病。因此建立一种简单快速有效的检测方法，采取相应的防御措施，有助于预防疾病的发生。LAMP技术是2000年以来Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，具有检测时间短，高灵敏度和高特异性，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。近年来已广泛用于各种病原检测。其特点是针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件1h内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到109拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。AmFV病毒是目前发现的唯一的双链DNA蜜蜂病毒，还没有相关的LAMP技术的研究与开发。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种快速、特异性好、灵敏度高的快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。本专利技术的第一个目的是提供利用环介导等温扩增检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：上游外引物F3：5’-TGGATCGTCGGGATCGTC-3’(如SEQIDNO.1所示)；下游外引物B3：5’-AACTCGGGAAACAGTGGC-3’(如SEQIDNO.2所示)；上游内引物FIP：5’-GTGACTCAAACAGACTCGCGGTCTGCTTCATCTGAACCGTCT-3’(如SEQIDNO.3所示)；下游内引物BIP：5’-GCGGGACCTCCTATTTCGCTGGTCAACTTGGCCCGTAACC-3’(如SEQIDNO.4所示)。本专利技术的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的蜜蜂丝状病毒的检测方法，其特征在于，提取样品总DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对样品DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。所述的样品优选为蜜蜂或蜂产品。蜜蜂可以为蜜蜂幼虫、蛹、成虫或其组织。蜂产品可以为蜂巢物质，花粉等。所述的通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对样品DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mMdNTPs、0.5μL10μM上游外引物F3、0.5μL10μM下游外引物B3、1μL40μM上游内引物FIP、1μL40μM下游内引物BIP、0.6μL100mMMgSO4、12.5μL2M甜菜碱、4μL灭菌双蒸水，1μL8U/μLBstDNA聚合酶和1μL样品DNA模板，反应条件为在温度为60℃～65℃孵育45～60min。所述的确认是否存在有扩增产物可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测环介导等温扩增反应产物是否具有扩增产物，优选用荧光显色检测，具体是在80℃终止反应1～2min，在扩增反应管中加入SYBRGreenⅠ显色剂，1～5min后观察结果，如果颜色为橙色，则样品蜜蜂丝状病毒阴性，无蜜蜂丝状病毒，如果颜色为绿色，则样品蜜蜂丝状病毒阳性，含有蜜蜂丝状病毒。所述的10×Thermopol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到，其含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(TtitonX-100)，余量为水。本专利技术的第三个目的是提供一种蜜蜂丝状病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：上游外引物F3：5’-TGGATCGTCGGGATCGTC-3’(如SEQIDNO.1所示)；下游外引物B3：5’-AACTCGGGAAACAGTGGC-3’(如SEQIDNO.2所示)；上游内引物FIP：5’-GTGACTCAAACAGACTCGCGGTCTGCTTCATCTGAACCGTCT-3’(如SEQIDNO.3所示)；下游内引物BIP：5’-GCGGGACCTCCTATTTCGCTGGTCAACTTGGCCCGTAACC-3’(如SEQIDNO.4所示)。本专利技术针对蜜蜂丝状病毒的ATPase特异性靶基因设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待检测样品中是否存在蜜蜂丝状病毒的检测方法。本专利技术的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花4h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，比其他PCR技术具有更高的特异性。特别适合蜜蜂病原调查与疾病防控。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。1、蜜蜂组织DNA提取液蜜蜂组织DNA提取液是购买的KAPA公司的昆虫组织DNA提取试剂盒。2、LAMP快速检测系列试剂(1)环介导等温扩增反应液：含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500μMdNTPs(四种脱氧核苷酸的混合物)、4-6mL硫酸镁(MgSO4)、0.1-0.3μM外引物(F3/B3)，1-2μM内引物(FIP/BIP)、0.8-1M甜菜碱。其中10×Thermopol缓冲液含有200mMpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾(KCl)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、20mM硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(TtitonX-100)，余量为水。检测引物组：上游外引物F3(5’-3’)：TGGATCGTCGGGATCGTC(如SEQIDNO.1所示)；下游外引物B3(5’-3’)：AACTCGGGAAACAGTGGC(如SEQIDNO.2所示)；上游内引物FIP(5’-3’)：GTGACTCAAACAGACTCGCGGTCTGCTTCATCTGAACCGTCT(如SEQIDNO.3所示)；下游内引物BIP(5’-3’)：GCGGGACCTCCTATTTCGCTGGTCAACTTGGCCCGTAACC(如SEQIDNO.4所示)。(2)BstDNA聚合酶：每微升含有8个活性单位(8U/μL)(3)显色剂：10％的荧光染料SYBRGREENⅠ上述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管23μL的最佳组成为：2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mMdNTPs、0.5μL10μM上游外引物F3、0.5μL10μM下游外引物B3、1μL40μM上游内引物FIP、1μL40μM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用环介导等温扩增检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：上游外引物F3：5’‑TGGATCGTCGGGATCGTC‑3’；下游外引物B3：5’‑AACTCGGGAAACAGTGGC‑3’；上游内引物FIP：5’‑GTGACTCAAACAGACTCGCGGTCTGCTTCATCTGAACCGTCT‑3’；下游内引物BIP：5’‑GCGGGACCTCCTATTTCGCTGGTCAACTTGGCCCGTAACC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种利用环介导等温扩增检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：上游外引物F3：5’-TGGATCGTCGGGATCGTC-3’；下游外引物B3：5’-AACTCGGGAAACAGTGGC-3’；上游内引物FIP：5’-GTGACTCAAACAGACTCGCGGTCTGCTTCATCTGAACCGTCT-3’；下游内引物BIP：5’-GCGGGACCTCCTATTTCGCTGGTCAACTTGGCCCGTAACC-3’。2.一种非疾病的诊断和治疗目的的蜜蜂丝状病毒的检测方法，其特征在于，提取样品总DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对样品DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为蜜蜂或蜂产品。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对样品DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祎，韩日畴，
申请(专利权)人：广东省生物资源应用研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44