鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的PCR检测试剂盒及其专用引物制造技术

本发明专利技术提供了一种可特异性鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的普通PCR检测试剂盒及其专用引物。利用本发明专利技术的引物或试剂盒对BVDV检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可用于I型、II型牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的检测，还可实现与猪瘟病毒的鉴别，可用于猪瘟病毒疫苗生产中质量监控、犊牛产品质检等领域。

Identification of swine fever virus and bovine viral diarrhea mucosal disease virus PCR detection kit and its special primer

The present invention provides a highly specific identification of classical swine fever virus and bovine viral diarrhea mucosal disease virus PCR detection kit and its special primer. The detection of BVDV has the advantages of simple operation, strong specificity, high sensitivity and good reproducibility using primers or the reagent kit of the invention not only can be used for detection of type I and type II bovine viral diarrhea mucosal disease virus, but also can realize the identification of classical swine fever virus, can be used for vaccine of classical swine fever virus production and quality control product quality inspection and other fields of calves.

【技术实现步骤摘要】
鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的PCR检测试剂盒及其专用引物
本专利技术属于生物检测
中的兽医动物病原检测，特别是涉及一种能够特异性鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(I型和II型)的普通PCR检测试剂盒及其专用引物。
技术介绍
瘟病毒属瘟病毒属包括粘膜病病毒群的病毒以及猪瘟病毒和羊边界病病毒。病毒粒子呈圆形，有脂蛋白的囊膜，在细胞浆内增殖和发育成熟，是最小的有囊膜的RNA病毒(直径约40nm)，内含非螺旋状的、有可能是二十面体对称的核衣壳。基因组为单分子的单股RNA，本身就可作为信息RNA(mRNA)。瘟病毒不能在无脊椎动物体内增殖。血清学上与本属内的病毒呈现交叉反应，但与黄病毒科其它属的病毒成员没有交叉关系。猪瘟病毒和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(I型和II型)猪瘟(Classicalswinefever,CSF)又称猪霍乱(Hogcholera，HC),是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物传染病。猪瘟的临床症状由急性、亚急性逐渐转变为慢性温和型，临床症状不典型，在猪瘟高发地区，主要采用常规的免疫接种进行猪瘟的预防。疫苗的品质则直接决定猪群抵抗猪瘟病毒的能力，现常用的猪瘟疫苗有传代细胞源、兔源等不同厂家的猪瘟疫苗，因猪瘟疫苗生产离不开细胞培养，细胞培养最重要的原材料之一为血清，血清主要来源于牛血清。随着牛群的进口引进，目前，牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)分布于世界各地，从20世纪八、九十年代以来，在北美州，美国、加拿大BVD-MD的感染率达到50％-85％；在欧洲、法国、德国，经血清学调查结果显示BVD-MD的感染率为76％，瑞典的发病率在10％-80％之间，芬兰肉牛的感染率不小于50％，希腊阳性率为1.3％-14％，立陶宛阳性率为70％-100％，瑞士和波兰的平均阳性率分别为12.5％和86％；在南美洲，巴西、委内瑞拉、秘鲁、新西兰及澳大利亚BVD-MD的阳性率分别为15.1％-56％、36％-37％、50％-96％和89％。因牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)病毒(BVDV)的广泛存在，生产猪瘟疫苗等疫苗类产品时为避免原材料血清被BVDV污染，需要建立一种快速、简单的对牛血清中的BVDV进行检测的方法。CSFV和BVDV的检测由于CSFV和BVDV是同一个属的成员，同源性高，具有很强的血清学交叉反应，生产猪瘟细胞苗常利用牛睾丸细胞和胎牛血清来扩大培养猪瘟病毒，若牛睾丸细胞或胎牛血清被BVDV污染，会直接导致猪瘟细胞苗污染BVDV病毒，导致CSFV疫苗不纯净，并且，用含有BVDV抗体的血清进行CFSV病毒的体外培养对CFSV病毒具有抑制作用，因此为保证猪瘟细胞源疫苗的安全性及有效性，BVDV病毒和CSFV病毒的鉴别尤为重要。常规的鉴别是对BVDV病毒和CSFV病毒分别检测，常用的CSFV和BVDV检测方法有琼脂扩散试验、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、动物接种试验、病毒中和试验、常规PCR试验和RT-PCR试验等，因琼脂扩散试验、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、动物接种试验和病毒中和试验费时、费力，并且成本较高，现常用的检测方法为PCR技术，由于实时荧光定量PCR技术的仪器昂贵、成本高，因此普通PCR检测技术为首选的CSFV和BVDV的检测技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行普通PCR检测的引物，并实现牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)的鉴别。本专利技术所提供的用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通PCR检测的引物为：上游引物(PU-BVDV-F)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，下游引物(PU-BVDV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。由上述引物衍生的引物序列也属于本
技术实现思路
。所述衍生序列是指在SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。本专利技术的第二个目的是提供用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行普通PCR检测的试剂盒。本专利技术所提供的普通PCR检测试剂盒，包括上述用于对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通PCR检测的引物。具体来讲，所述试剂盒还包括以下用于25μL普通PCR反应体系的试剂：一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(购于TakaRa公司)，PU-BVDV-F(20μM)0.5μL，PU-BVDV-R(20μM)0.5μL，RNA-freeH2O8.5μL，核酸模板2μL。该体系中引物稀释至20μM，反应体系中最终加量为0.4μmol/L。为方便检测，所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒I型和II型基因组RNA，所述阴性对照为不含I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。本专利技术的第三个目的是提供所述引物或试剂盒在对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行非疾病诊断目的的检测、或在对牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)进行非疾病诊断目的的鉴别的应用。该应用之一为一种用上述普通PCR检测试剂盒及普通PCR技术对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行非疾病诊断目的的定性检测的方法，该普通PCR检测方法包括以下步骤：1)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在上述引物引导下进行普通PCR扩增检测；2)用得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，实现对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的定性检测，出现预期目的条带“233bp”表明待测样品中含有I型和/或II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)，若无预期目的条带则表明待测样品中无I型和/或II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)。应用之二为一种非疾病诊断目的的鉴别I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)的方法，在上述步骤后还包括：3)结果判定：本专利技术的普通PCR检测方法只对BVDV样品有扩增条带而对CSFV样品无扩增条带，本专利技术充分利用两者基因序列的差异，在PU-BVDV-F序列上筛选出较好的8个位点(自5’端148、152、155、156、160、164、166、170位点)，在PU-BVDV-R序列上筛选出较好的1个位点(自5’端355位点)，用PU-BVDV-F和PU-BVDV-R可同时扩增I型和II型BVDV，PCR扩增若出现预期扩增条带“233bp”可以确认其为I型和/或II型BVDV病毒，因与CSFV序列具有8个碱基的差异无法扩增CSFV序列(未出现预期条带)，从而实现鉴别I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)的目的。具体判定方法：PCR扩增若出现预期扩增条带“233bp”，则本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于对牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒进行普通PCR检测的引物，包括：上游引物(PU‑BVDV‑F)，其核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(PU‑BVDV‑R)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.用于对牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通PCR检测的引物，包括：上游引物(PU-BVDV-F)，其核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，下游引物(PU-BVDV-R)，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。2.用于对牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通PCR检测的试剂盒，包括权利要求1所述用于对牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通PCR检测的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括以下用于25μL普通PCR反应体系的试剂：一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(购于TakaRa公司)，PU-BVDV-F(20μM)0.5μL，PU-BVDV-R(20μM)0.5μL，RNA-freeH2O8.5μL，核酸模板2μL；试剂盒中引物稀释为20μM，反应体系中引物最终浓度为0.4μmol/L。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒I型和II型基因组RNA，所述阴性对照为不含I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。5.一种用权利要求2-4任一所述的普通PCR检测试剂盒对I型和II型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)进行非疾病诊断目的定性检测的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在权利要求1所述引物的引导下进行普通P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳杰，陈君彦，张妍，王秀明，王云凌，张宸，刘建奇，魏学峰，刘国英，范秀丽，张贵刚，宋志刚，谯小燕，董佳，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15