一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有牛病毒性腹泻病毒。本发明专利技术还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3～8所示)以及试剂盒(由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成)。本发明专利技术的方法，既可用于牛病毒性腹泻病毒气溶胶样本的分型检测，也可用于临床血液、奶样、组织等样本的检测，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物
。
技术介绍
牛病毒性腹?写(Bovineviraldiarrhea, BVD)是由牛病毒性腹?写病毒(Bovineviral diarrheavirus, BVDV)引起的传染病，呈地方性流行。本病可通过接触及气溶胶等方式传播，病牛及隐性感染牛的呼吸道、眼分泌物、乳汁及粪便等排泄物均含有病毒，在封闭式牛群中可呈暴发式流行，给畜牧业生产和相关商业领域造成巨大的经济损失。BVDV是单股正链RNA病毒，有囊膜，基因组由5’端非翻译区(5’NTR)，一个长的开放阅读框，编码病毒的结构蛋白，包括病毒的衣壳蛋白和囊膜蛋白(Erns、El和E2)和非结构蛋白，和3’端非翻译区(3’ NTR)组成。根据BVDV基因组5’端非翻译区(5’ NTR)序列不同，把BVDV分为牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1)和牛病毒性腹泻病毒II型(BVDV-2)。BVDV流行株的基因分型在流行病学研究、疫苗研制乃至疫病的控制和消灭等方面都具有重要的意义。实时荧光定量RT-PCR技术巧妙地利用了 PCR技术的DNA高效扩增、荧光技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：步骤如下：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：所述试剂盒由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY‑T3‑B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成；所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY‑T3‑B1由序列为SEQIDNO.9所示的DNA片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物...

【技术特征摘要】
1.一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于:步骤如下: (1)采集气溶胶样本； (2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA； (3)检测:以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR,具体如下: 所述试剂盒由特 异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒PEASY-T3-B1、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂和ddH20组成； 所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒PEASY-T3-B1由序列为SEQIDN0.9所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒II型鉴别检测引物对； 所述通用型检测引物对的序列如下: 上游引物 RT-F 为 5' -TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3'；下游引物 RT-R 为 5’ -CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3’ ； 所述牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒II型鉴别检测引物对的序列如下: 牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对: 上游引物 RT-1-F 为 5' -TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3'； 下游引物 RT-1-R 为为 5' -GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3'； 牛病毒性腹泻病毒II型鉴别检测引物对: 上游引物 RT-2-F 为 5' -AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3'； 下游引物 RT-2-R 为 5' -GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3'； (4)建立标准曲线和溶解曲线:建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线； (5)判断:当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹?写病毒；若溶解曲线为一条直线，贝1J表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒； 当所用特异性引物为牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒II型鉴别检测引物对时，若对应于牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹湾病毒I型；若溶解曲线为一条直线，贝1J表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒I型； 若对应于牛病毒性腹泻病毒II型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒II型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒II型。2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为:采用全玻璃液体冲击式采样器，以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本。3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，提取RNA和cDNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在4°C下12000r/min离心30min，取上清液lmL，应用病毒RNA试剂盒提取病毒的总RNA ;将RNA提取物溶解于.50 μ LRNAase-free 水中，按照 FermentasRevertAid?FirstStrandcDNASynthesisKit 说明书进行RT-PCR反应，得到cDNA。4.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，PCR的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，侯佩莉，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37