牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感的三联灭活疫苗及其制备方法。本发明专利技术所述疫苗其有效成分包括牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒与牛副流感3型病毒的灭活抗原,该三联灭活疫苗是利用细胞转瓶、全悬浮及微载体培养的传代细胞系进行病毒增殖，并对制苗工艺等进行了优化。疫苗安全和效力检验结果显示：使用本发明专利技术的三联灭活疫苗免疫牛后没有任何局部和全身不良反应，所有的牛都产生了免疫保护，说明本发明专利技术的疫苗安全可靠，可达到“一针三防”的目的，降低经济损失。

Triple inactivated vaccine for bovine viral diarrhea, bovine infectious bronchitis and bovine parainfluenza, and preparation method thereof

The invention relates to a triple inactivated vaccine for preventing bovine viral diarrhea, bovine infectious bronchitis and bovine parainfluenza, and a preparation method thereof. The inactivated vaccine of the effective components including bovine viral diarrhea virus, infectious bovine rhinotracheitis virus and bovine parainfluenza virus type 3, the inactivated vaccine is the use of cells into the bottle, full suspension and microcarrier cell line the proliferation of virus, and the vaccine technology etc. optimized. Vaccine safety and efficacy test results showed that: the use of the triple inactivated vaccine of a no local and systemic adverse reactions, all the cattle have immune protection, that the vaccine of the invention is safe and reliable, can achieve \a three\ to reduce economic losses.

【技术实现步骤摘要】
牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea,BVD)是由属于黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)引起的一种病毒性传染病，主要侵害牛、羊、鹿、耗牛、猪等动物，各年龄牛均易感。临床主要表现为腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制，怀孕母畜流产或产生畸形胎儿等。1946年Olafson等在美国首次发现该病，以发热、腹泻和咳嗽为特征，称为牛病毒性腹泻。Ramsey和Chiverst于1953年首先发现了黏膜病(Mucosaldisease，MD)，1971年美国兽医协会将其统一命名为牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD)。该病在世界范围内广泛分布，是造成全球养牛业经济损失的主要病原。上世纪80年代初，李佑民等首次在流产胎儿的脾脏中分离并鉴定出BVDV，证明该病在我国的存在。血清学调查表明，BVD在我国呈上升趋势。牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis,IBR)是由属于疱疹病毒科、水痘病毒属的牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisVirus,IBRV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，又称为“坏死性鼻炎”或“红鼻病”。IBRV即牛I型疱疹病毒(BoHV-1)，能够在牛体内侵害多种系统的组织和器官，临床症状表现为高热，病牛体温可达40℃以上、食欲降低、呼吸困难、流鼻液、上呼吸道及气管黏膜发炎，病毒还可侵害生殖道。病毒感染能够诱发产奶量下降和流产，并导致肉用牛和康复牛的生长缓慢，给养牛业造成极大的损失。该病最早于上世纪50年代在美国的科罗拉多州被发现，Madin在1956年首次从病牛体内分离得到IBRV。1980年，周泰冲等首次在我国从新西兰引进的奶牛中分离鉴定了IBRV，之后广东、广西、河北、河南、内蒙古、新疆、山东、青海、黑龙江等全国各地的黑白花、本地黄牛、牦牛和水牛均有IBR感染的报道。血清学调查显示，IBR在我国牛群中广泛流行，且呈明显上升趋势。牛副流感(Bovineparainfluenza，BP)是由属于副黏病毒科、呼吸道病毒属的牛副流感3型病毒(Bovineparainfluenzavirustype3，BPIV3)引起的一种急性呼吸道疾病，其引起的病症为牛副流行性感冒，又称“运输热”，是一种急性接触性传染病，BPIV3对牛的致病力不强，但在继发细菌、支原体及外界诱因的联合作用下，则可产生严重呼吸道症状，甚至可引起病牛的死亡。BP与BVD、IBR一起构成了牛呼吸道综合征(Bovinerespiratorydiseasecomplex,BRDC)的主要病原。目前，BRDC是引起世界范围内的饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害养牛业的健康发展。BP在世界上许多国家流行，我国于2008年在黑龙江首次分离到BPIV3，研究表明，BPIV3在我国抗体阳性率高。
技术实现思路
本专利技术的目在于采用一种牛肾细胞(MDBK)繁殖牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒，进而将此三种病毒作为抗原制备成预防BVD、IBR和BP的三联灭活疫苗。本专利技术的技术方案1.一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒及牛副流感3型病毒的灭活抗原。2.本专利技术所述的牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗，其特征在于所述灭活抗原是牛病毒性腹泻病毒L株、牛传染性鼻气管炎病毒J1株及牛副流感3型病毒S株的灭活病毒，该三株病毒已于2017年03月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCCNo.13787、CGMCCNo.13786、CGMCCNo.13788。3.本专利技术所述的牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法步骤包括：(1)细胞培养：将牛肾细胞系(MDBK)采用贴壁培养或者悬浮培养或者微载体培养的的方式进行传代和培养；(2)毒种繁殖：将牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒及牛副流感3型病毒作为生产种毒共同接种在牛肾细胞上，并通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；(3)抗原灭活：将制备的病毒液使用灭活剂进行灭活；(4)配苗：加入相应的佐剂或者直接将灭活好的抗原进行配苗。本专利技术具体实施方式1.BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株的分离鉴定(1)本专利技术所用毒株BVDV-L株于2010年分离自疑似发病牛的粪便，接种MDBK细胞后可产生细胞病变，能被BVDV标准阳性血清中和，BVDVIFA荧光抗体检测阳性，参照规程SN/T1905-2007，针对BVDV5’-UTR设计特异性引物，引物序列如下：BVDV-P1：5’-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3’20(序列1)BVDV-P2：5’-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3’19(序列2)RT-PCR后扩增出288bp特异性片段。(2)IBRV-J1株于2011年分离自疑似发病牛的鼻拭子，接种MDBK细胞30h即可产生细胞病变，能被IBRV标准阳性血清中和，参照规程SN/T1918-2007，设计了扩增IBRVgB、gE基因的特异性引物，引物序列如下：gB-P1：5’-TACGACTCGTTCGCGCTCTC-3’20(序列3)gB-P2：5’-GGTACGTCTCCAAGCTGCCC-3’20(序列4)gE-P1：5’-GCTTCGGTCGACACGGTCTT-3’20(序列5)gE-P2：5’-CTTTGTCGCCCGTTGAGTCG-3’20(序列6)提取DNA后PCR分别扩增出491bp(gB基因)、271bp(gE基因)的特异性片段。(3)BPIV3-S株分离自疑似发病牛的鼻拭子，接种MDBK细胞能产生细胞病变，根据病毒N蛋白设计特异性引物(参照文献牛副流感病毒3型的分离鉴定和间接ELISA方法建立及初步应用，刘鹏，2010)，引物序列如下：BPIV3-P1：5'-GAGAAAGACCCAGGAAGACAGA-3'22(序列7)BPIV3-P2：5'-ACACCCATCGCATAACTCCAGA-3'22(序列8)提取RNA后RT-PCR可扩增出704bp的特异性片段。2.抗原制备为解决BVDV、IBRV、BPIV3适应转瓶贴壁培养、悬浮培养、微载体悬浮培养细胞牛肾细胞系MDBK(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)过程中出现的一系列问题，本专利技术提供了利用转瓶贴壁培养、悬浮培养技术、微载体悬浮培养技术制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株的方法。(1)利用转瓶贴壁培养细胞制备BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原1)培养细胞：首先复苏种细胞牛肾细胞系MDBK到细胞瓶中，生长48小时左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:3的比例进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒及牛副流感3型病毒的灭活抗原。

【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒及牛副流感3型病毒的灭活抗原。2.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感三联灭活疫苗，其特征在于所述灭活抗原是牛病毒性腹泻病毒L株、牛传染性鼻气管炎病毒J1株及牛副流感3型病毒S株的灭活病毒，该三株病毒已于2017年03月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCCNo.13787、CG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蕾，徐龙涛，毕玉彧，禚宝山，高凤，鞠洪涛，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37