抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，其包括：包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板、IBRV阳性标准血清、阴性血清、酶标记二抗、底物显色液、终止液。本发明专利技术利用抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体，在酶联板捕获受感染的MDBK细胞裂解物中的牛传染性鼻气管炎病毒，通过方阵滴定法确定了单克隆抗体和病毒抗原的最佳包被浓度。本发明专利技术试剂盒具有良好的特异性、敏感性，中和符合率高，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体的检测技术，具体涉及到一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，本专利技术还涉及该试剂盒的制备方法。
技术介绍
牛传染性鼻气管炎(bovineinfectiousrhinotracheitis,IBR)，又名“坏死性鼻炎”或“红鼻病”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus,IBRV)引起牛的一种接触性传染病。病牛临床上主要以呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等呼吸道症状为主，部分病牛还会出现眼结膜炎、脑膜脑炎、乳房炎、流产、生殖道感染等多种病症[1]。该病能够延缓育肥牛生长、奶牛产奶量下降、生殖力下降、流产等，牛群淘汰率和死亡率增加，给养牛业带来巨大经济损失[2]。病毒还可侵入牛的三叉神经节和荐神经节，中和抗体不能中和潜伏于神经节内的病毒，造成病毒的潜伏感染，病牛长期乃至终身带毒，并成为传染源，持续向外界环境排毒。病毒通过空气传播，使无IBR的健康牛受感染，给控制和消灭本病带来极大困难[3]。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物传染病，我国将其列为二类动物传染病。由于清除IBRV血清反应阳性牛已成为一些经济发达国家消灭和根除本病的主要措施之一，因此有必要建立检测IBRV的血清抗体方法。迄今，牛传染性鼻气管炎血清抗体的检测方法有：间接血凝试验(IHA)、间接免疫荧光试验(IFA)、免疫胶体金试验、中和试验(SN)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)。间接血凝试验是用鞣酸处理的绵羊红细胞吸附病毒抗原后进行间接血凝试验，以检测被检血清中的相应抗体。该方法简单易行，适用于IBR血清抗体检测，但其抗原制备过程繁琐费时，而且在进行HI试验时，容易发生交叉反应，混淆检测结果；间接免疫荧光试验(IFA)是一种免疫标记技术。通常将抗牛免疫球蛋白第二抗体与异硫氰荧光素连接成荧光抗体，待检血清加到接有IBRV的细胞培养物表面，置荧光显微镜下观察结果。IFA用于诊断具有快速、简便、敏感性好的特点，而且费用较低。该方法的缺点是标本中出现的假阳性(非特异性荧光)。免疫胶体金试验是利用胶体金标记的单抗与抗原符合物在滤纸上，当结合到待检血清中的抗体时，形成肉眼可见的条带。胶体金斑点免疫渗滤法用于IBR抗体检测，仅需5min即可判定结果，但该方法制作成本高，敏感性较差，不适合大规模的临床样品的检测。中和试验是通过在易感动物细胞上进行中和试验即可做出诊断。将IBRV接种至单层生长的MDBK细胞，CPE达80％时收毒，反复冻融3次后离心去除细胞裂解碎片，收获病毒液。测定病毒液的TCID50后分装，置-20℃待用。将标准血清和待检血清56℃灭活30min，再和等体积的100TCID50病毒液混合，37℃中和1h后，加入MBDK细胞悬液，37℃CO2培养箱中培养72h后判定结果。中和试验被认为是最标准、最经典的血清抗体检测方法，但其敏感性相对较低，而且中和试验时必须设立标准阳性、阴性血清对照，病毒抗原对照，且涉及到细胞培养、细胞传代、病毒效价测定等步骤，操作复杂，试验周期长，加上IBRV常呈隐性感染状态或处于潜伏期，导致中和试验结果为阴性，但仍不能保证无病毒感染。酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前应用最广泛的病毒抗体的检测技术。它具有敏感、特异、快速等特点，且需要的设备和技术条件不高，非常适用于目前的生产实际。现已被广泛应用于IBR的检测，是国际贸易指定检测方法之一。用于IBR诊断的ELISA方法主要有：间接法、阻断法、单抗捕获法、夹心法，其中以间接ELISA最为常用。David等于1981年用全病毒建立了间接ELISA诊断方法，VanOirschot用制备的两种单克隆抗体建立ELISA方法用于检测IBRV。Florent等[应用IBRVIgM抗体作为包被抗体，建立检测IBRV的单抗捕获ELISA法，该方法能对IBRV的早期感染进行检测，在临床症状出现后5-10天的自然感染或试验感染动物血清中即可检测出IBRV抗体。目前，IDEXX等国外公司已有商品化的IBR阻断ELISA试剂盒销售到我国市场，但其昂贵的价格令奶牛场很难承受，促使国内学者不断研制具有自主知识产权的ELISA方法。朱元茂等用IBRV全病毒作为诊断抗原建立间接ELISA方法，与法国试剂盒的符合率为96.3％。李伟等用IBRVgB蛋白建立间接ELISA方法，与IDEXX试剂盒相比，符合率为92％。颜邦芬用IBRv的gG蛋白建立间接ELISA方法，与IDEXX试剂盒的符合率为93.3％。王海燕等用IBRgE蛋白建立检测gE抗体的间接ELISA方法，与法国试剂盒的符合率为94.3％，且该方法可用于区分野毒株和gE基因缺失疫苗株。然而，上述ELISA中所用抗原是要么是通过密度梯度离心法将浓缩的IBRV纯化和灭活后得到的，要么将IBR病毒的外膜糖蛋白(如gB,gC,gD,gE等)在大肠杆菌中表达，然后将纯化的表达产物作为包被抗原，以此建立不同形式的ELISA。但IBR病毒的外膜糖蛋白基因的原核表达产物为不可溶蛋白，需要进行变性、复性才能获得纯化产物，而表达产物在变性、复性后，空间结构往往会发生一定程度的改变，致使检测方法的敏感性降低；此外，上述2种纯化方法得到的抗原纯度很难达到建立ELISA的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述不足提供一种用于检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的ELISA试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，其包括：包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板、IBRV阳性标准血清、阴性血清、酶标记二抗、底物显色液、终止液。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体的包被浓度为1.0μg/mL，包被量为100μL/孔。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述IBRV抗原的浓度为包被浓度为12.5μg/mL，包被量为100μL/孔。所述酶标记二抗可以是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗，在本专利技术的一个优选实施方式中，所述酶标二抗是HRP标记兔抗牛IgG。当HRP作为标记酶时，可以用诸如邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)作为色原底物。在本专利技术中一种优选的实施方式，所述底物显色液的配置如下(1升体系)：所述终止液为2MH2SO4。进一步地，所述试剂盒还包括血清稀释液其为PBST。进一步地，所述试剂盒还包括HRP标记兔抗牛IgG稀释液，其为含3％BSA的PBST。本专利技术还提供制备上述试剂盒的方法，包括制备包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板的步骤：将抗牛传染性鼻气管炎病毒gD单克隆抗体包被酶标板，用固相化的单抗捕获病毒感染细胞裂解物种的牛传染性鼻气管炎病毒抗原。一种优选的实施方式是，所述制备包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板的步骤为：将抗牛传染性鼻气管炎病毒gD单克隆抗体按100μL/孔包被酶标板，37℃温育2h，4℃过夜，倒出孔内液体，加入300μl/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次；加封闭液100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次；加入IB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，其包括：包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板、IBRV阳性标准血清、阴性血清、酶标记二抗、底物显色液、终止液。

【技术特征摘要】
1.一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，其包括：包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板、IBRV阳性标准血清、阴性血清、酶标记二抗、底物显色液、终止液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体的包被浓度为1.0μg/mL，包被量为100μL/孔。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述IBRV抗原的浓度为包被浓度为12.5μg/mL，包被量为100μL/孔。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记二抗为HRP标记兔抗牛IgG。5.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液的配置如下：6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为2MH2SO4。7.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括血清稀释液其为PBST。8.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永清，许健，黄秀芬，叶丽娜，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11