用于同时检测五种牛病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒和口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针。所述多重连接探针如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示，所述引物如序列表SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：12所示。使用本发明专利技术所述的引物、探针，和/或包含该引物和探针的多重连接探针扩增检测试剂盒可同时检测蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒和口蹄疫病毒5种重要牛病病原，节约了检测时间和成本，有利于疫病的及时确诊。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种用于检测蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛地方流行性白血病、牛传染 性鼻气管炎、口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针，可实现一次采样， 一次分析，同时检测5种牛病的目的，属于检验检疫领域。
技术介绍
蓝舌病病毒（BTV)、牛病毒性腹泻病毒（BVDV)、牛地方流行性白血病病毒（EBLV)、 牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV)、口蹄疫病毒（FMDV)是引起牛呼吸道疾病、繁殖障碍和消化 道疾病的主要常见病原，是危害养牛业最为严重的几种病原，被世界动物卫生组织（OIE) 规定为跨界传播病原，也是我国动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象。 目前，针对上述5种牛病病原建立了多种分子检测技术，如PCR和荧光PCR技术 等，在这些疫病的诊断和防控中发挥了重要作用。但目前所建立的方法多是针对一种病原 的单目标检测，在实际检测中需要重复多次，才能完成检测不同病原的目的，检测工作量大 且时间长，不能满足大批量动物检疫快速通关的实际需要。且难以实现实际样品中大量存 在的混合感染以及症状相似疫病的鉴别诊断。在建立单目标病原检测技术的同时，各国兽 医机构也相继研制了可同时检测牛常见病毒的多重PCR及多重荧光PCR，但传统PCR技术灵 敏度低、结果不易判定等缺点限制了其在多重检测中的应用，而荧光PCR由于不同探针采 用的焚光集团所发射的焚光存在相互干扰，且焚光PCR仪对不同波长焚光分辨的局限性也 限制了荧光PCR多重检测技术的发展。 本研究利用多重连接探针扩增技术（Multiplexligation-dependentprobe amplification，MLPA)在核酸检测方面具有的特异、敏感，适合多重检测等优点，建立了 BTV、BVDV、EBLV、IBRV、FMDV五种牛病病原的MLPA检测方法并组装成试剂盒，在国内外首次 实现一次采样，一次分析，检测5种重要牛病的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且 能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防制赢得时间。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的同时检测蓝舌病病毒（BTV)、牛 病毒性腹泻病毒（BVDV)、牛地方流行性白血病病毒（EBLV)、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV) 和口蹄疫病毒（FMDV)的多重连接探针及一对通用引物。 本专利技术的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的同时检测蓝舌病病毒（BTV)、 牛病毒性腹泻病毒（BVDV)、牛地方流行性白血病病毒（EBLV)、牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV)和口蹄疫病毒（FMDV)的多重连接探针扩增检测试剂盒。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案： 在序列比对分析的基础上，针对蓝舌病病毒NS3基因、牛病毒性腹泻病毒5'UTR基 因、牛地方流行性白血病病毒gP51基因、牛传染性鼻气管炎病毒gB基因、口蹄疫病毒3D基 因，分别设计一对长探针和短探针（序列见表1)，同时设计一对PCR扩增的通用引物（序 列见表2)。短探针由两段核苷酸组成，一段是PCR扩增的通用引物，一段是病毒特异性序 列；长探针由三段核苷酸组成，除了PCR扩增的通用引物和病毒特异性序列外，在两者之间 还加入特定大小的填充序列；且位于右侧的探针5'端进行磷酸化处理。通过在上述5种病 毒的长探针中加入不同长度的填充序列，然后通过病毒模板变性、探针杂交、连接及通用引 物PCR扩增得到不同大小的PCR产物，通过毛细管电泳分析后实现对5种病毒的同时检测。 表1蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒、牛传染性鼻气管 炎病毒和口蹄疫病毒探针名称和序列 其中，上述SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8和SEQIDNO: 10的5'端进行磷酸化处理； 表2.通用引物序列 注：胞嘧啶（C)、鸟嘌呤（G)、腺嘌呤（A)、胸腺嘧啶（T)。 我们采用多重连接探针扩增技术建立了同时检测蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病 毒、牛地方流行性白血病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和口蹄疫病毒的检测方法并组装了 试剂盒。 检测蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒、牛传染性鼻气管 炎病毒和口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒，包括： (I)MLPA缓冲液； (2)探针，其包括检测蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒、 牛传染性鼻气管炎病毒和口蹄疫病毒的长、短探针，所述探针的序列见表1，其中，所述SEQ IDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8 和SEQIDNO: 10 的 5' 端进行了磷酸 化处理；本专利技术的一个实施方案中，每种探针的浓度为lyM，使用时各取0.8yL，加水至终 体积600yL，配制成探针混合物； (3)连接反应液，其包括：Ligase-65缓冲液A和Ligase-65缓冲液B，在本专利技术的 一个实施方案中，连接反应液的配方如表3所示； 表3连接反应液配方 (4)Ligase-65 连接酶； (5)PCR反应液，其包括如序列表SEQIDNO: 11至SEQIDNO:12所示的通用引物； (6)SALSA聚合酶； (7)DEPC水； (8)阴性对照：无核酸灭菌水； (9)阳性对照：为蓝舌病病毒NS3基因、牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因、牛地方流 行性白血病病毒gP51基因、牛传染性鼻气管炎病毒gB基因、口蹄疫病毒3D基因的阳性重 组质粒DNA的混合物。 蓝舌病病毒NS3基因阳性重组质粒的制备：克隆蓝舌病病毒NS3基因，回收PCR扩 增产物，长度为492bp，与pGEM-T载体（购自PromeGA公司）进行连接，转化JM109感受态 细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得蓝舌病病毒NS3的阳性重组质粒，命 名为BTV-NS3-DNA;蓝舌病病毒NS3基因序列如序列表中SEQIDNO:13所示。 牛传染性鼻气管炎病毒gB基因阳性重组质粒的制备：克隆牛传染性鼻气管炎病 毒gB基因，回收PCR扩增产物，长度为365bp，与pGEM-T载体（购自PromeGA公司）进行连 接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得牛传染性鼻气 管炎病毒gB基因的阳性重组质粒，命名为IBRV-gB-DNA;牛传染性鼻气管炎病毒gB基因基 因序列如序列表中SEQIDNO:14所示。 牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因的阳性重组质粒的制备：克隆牛病毒性腹泻病毒 5'UTR基因，回收PCR扩增产物，长度为284bp，与pGEM-T载体（购自PromeGA公司）进行 连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得牛病毒性 腹泻病毒5'UTR基因的阳性重组质粒，命名为BVDV-5'UTR-DNA;牛病毒性腹泻病毒5'UTR 基因序列如序列表中SEQIDNO:15所不。 牛地方流行性白血病病毒gP51基因的阳性重组质粒的制备：克隆牛地方流行性 白血病病毒gP51基因，回收PCR扩增产物，长度为500bp，与pGEM-T载体（购自PromeGA公 司）进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得牛 地方流行性白血病病毒gP51基因的阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于同时检测蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒和口蹄疫病毒的引物和多重连接探针，其特征在于，所述多重连接探针如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示，所述引物如序列表SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：12所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：史喜菊，马贵平，柏亚铎，郝俊虎，乔彩霞，刘全国，李炎鑫，李冰玲，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：北京;11