本发明专利技术涉及牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及应用。其优点为：(1)建立了高效获取BVDV E2蛋白的表达、纯化方法，可制备纯的BVDV E2蛋白；(2)仅用BVDV的E2蛋白免疫兔子制备抗体，比用全病毒免疫牛本身制备的抗体特异性好，背景浅，易判定；使用FITC标记二抗，建立了间接荧光法，因此敏感性更好；操作简单：采用预混液，减少操作时间；(3)用纯的BVDV E2蛋白包被，优化了封闭条件、血清及抗体保存液，建立了BVDV抗体间接ELISA方法，组装了敏感且价格低廉的BVDV抗体间接ELISA试剂盒，可改变长期依赖进口BVDV抗体ELISA试剂盒的局面。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及在牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA试剂盒的组装和牛病毒性腹泻病毒间接免疫荧光检测试剂盒的组装应用，属兽用生物制品领域。技术背景牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)与猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)均属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员。而BVDV有I型和II型两种生物型，在我国主要为I型。我国近几年来牛感染BVDV而持续带毒现象非常普遍。猪瘟活疫苗在生产过种中要用到牛血清、胰酶、牛睾丸等材料，这些材料中若带有低滴度的BVDV，会造成猪瘟细胞苗的污染。另外，用含BVDV抗体的牛血清也会干扰猪瘟病毒的体外培养。更为严重的是，猪使用被BVDV污染的猪瘟疫苗后可感染BVDV，出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。为了有效防控BVDV在牛群中的流行，控制猪用活疫苗的生物原料质量，开发BVDV抗体和抗原检测试剂具有重要意义。目前，检测BVDV方法主要有病毒分离、血清中和试验和电镜检查等，这些方法耗时费力，需6～7d甚至更长时间才能获得检测结果，不利于实验室样品检测工作。目前一般使用免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验检测BVDV。但目前商品化的免疫荧光抗体是用BVDV全病毒免疫牛制备的，试验时背景深，效价低，给结果判定带来困难。酶联免疫吸附试验敏感性低，往往造成漏检。另外，BVDV抗体和抗原检测试剂主要依赖国外进口试剂，不利于我国BVDV防控工作的顺利开展。因此，急需开发价格低廉、敏感特异的BVDV抗体和病原检测试剂。E2蛋白是BVDV的主要结构蛋白，可产生保护性免疫反应。因此，是开发BVDV亚单位疫苗和检测试剂的首选靶蛋白。国内已采用了多种方式对其进行原核表达(如:徐兴然等,牛病毒性腹泻病病毒Changchun184株E2基因的克隆及在大肠杆中的高效表达，中国预防兽医学报，2005，27(2)：98-101；杨有武等,牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及多克隆抗体制备,动物医学进展，2013，34(9)：128-132)，但原核表达产物为包涵体，无正确结构，活性差。因此，需进一步研究BVDVE2蛋白的表达方法，以获取可溶性的高活性蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立BVDV E2蛋白的表达方法，开发BVDV抗体和抗原检测试剂。本专利技术的技术方案1.一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于该牛病毒性腹泻病毒(BVDV)I型E2蛋白是由含有BVDV E2基因与分泌信号肽Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列(序列3)的重组杆状病毒表达，该重组病毒被命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(简称杆状病毒)BacVME2-His株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.12544。2.如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的应用，其特征在于用该BVDV的E2蛋白免疫动物制备抗体，并用此抗体为基础组装的BVDV病原间接免疫荧光染色试剂盒。3.如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于用该BVDV的E2蛋白作为包被抗原，以及优化的封闭液、血清稀释液等组装成BVDV抗体间接ELISA试剂盒。本专利技术的主要技术原理参考BVDVI型E2基因序列，设计合成引物，从标准毒株BVDV BA株(CVCC AV69，中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p144)感染材料中提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增获得天然的BVDV E2基因；BVDE2F：5’-CAGTCGACCA CCTAGACTGC AAACCTG-3’27(序列1)BVDE2R：5’-ACCGGTACCT ATGGACTCGG CGAAGTAATC CTTGTG-3’36(序列2)再通过叠合PCR技术将天然的BVDV E2基因与分泌信号肽Mels基因及6聚组氨酸(6His)纯化标签融合，获得转移载体；将转移载体通过转座技术克隆至杆状病毒基因组中，构建重组杆状病毒，获得BVDV E2蛋白；将获得的BVDV E2蛋白加上适宜佐剂，乳化后免疫动物，制备高免血清，用于组装BVDV间接免疫荧光检测试剂盒；或者将纯化的BVDV E2蛋白包被抗原，经封闭后加入适宜二抗组装BVDV抗体间接ELISA试剂盒。本专利技术具体实施方式一、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)I型E2蛋白的表达1.BVDV E2基因序列的获得提取BVDV BA株(CVCC AV69)感染材料中提取病毒RNA，通过常规RT-PCR技术，获得BVDV E2基因，克隆至pMD 18载体，命名为：pMD-E2。2.E2基因与信号肽序列和6His融合分别提取pMD-E2，通过叠合PCR技术获得与信号肽Mels基因和6His的融合基因Mels-E2-6His(序列1)，克隆至pMD 18载体。构建的融合基因质粒命名为pMD-ME2-His。质粒pMD-ME2-His中携带的Mels-E2-6His序列(序列3):起始“ACCATG……TCGAC”为Mels序列(1-78)6His序列“GGTG……CATG”(1157-1210)3.亚克隆至杆状病毒转移载体将pMD-ME2-His和pFastBac1分别进行双酶切，纯化回收，酶切片断ME2-His与pFastBac1线性质粒连接，转化，鉴定，获得的新质粒命名为pFB-ME2-His。4.转座获得重组杆粒DNA将pFB-ME2-His转化DH10Bac(Invitrogen公司)构建出的杆粒DNA命名为：bME2-His。5.重组病毒的获得将重组杆粒bME2-His用转染试剂Cellfectin(Invitrogen)转染sf9细胞，扩大培养，收集培养上清进行PCR鉴定。获得杆状病毒BacVME2-His株，其建议的分类命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒，该毒株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.12544。6.表达分析将鉴定好的病毒传代扩大培养，第二代记为P2Stock，第三代记为P3Stock。前三代均做为种毒，取第3代培养上清接种48孔板中的sf9细胞，同时设不接毒对照。60小时后弃上请，用预冷的固定液(丙酮:甲醇＝1:1)固定。弃固定液，加鼠抗6His抗体，37℃孵育50min，用PBS洗3遍，加FITC标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育50min，用PBS洗3遍，荧光显微镜下观察(图1)。结果表明，接毒sf9细胞孔出现明显的亮绿色荧光(图1a)，而未接毒sf9细胞孔未显荧光(图1b)。说明重组病毒能表达BVDV E2蛋白。7.蛋白纯化将鉴定正确的种毒用sf9细胞扩增至P6代，测定病毒滴度。用ExpressFive培养基(Invitrogen公司)悬浮培养High Five昆虫细胞(Invitrogen公司)(27℃，180r/min震荡培养)，待High Five昆虫细胞长至对数本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于该牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白是由含有BVDV E2基因与分泌信号肽Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列(序列3)的重组杆状病毒表达，该重组病毒被命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(简称杆状病毒)BacVME2‑His株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.12544。
【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于该牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白是由含有BVDV E2基因与分泌信号肽Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列(序列3)的重组杆状病毒表达，该重组病毒被命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(简称杆状病毒)BacVME2-His株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物...
【专利技术属性】
技术研发人员：范学政，徐璐，赵启祖，宁宜宝，丁家波，姚文生，王芳，王琴，邹兴启，朱元源，朱良全，蒋卉，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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