基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法技术

技术编号：40963651 阅读：12 留言：0更新日期：2024-04-18 20:43

本发明专利技术公开了一种基于双重LAMP‑LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法，属于分子生物检测领域，试剂盒至少包括双重LAMP引物组合(SEQ ID No.1～SEQ ID No.8)；可根据需要添加LAMP反应预混液、Bst II DNA聚合酶、阳性对照(猪链球菌和副猪格拉瑟菌DNA)、阴性对照(ddH<subgt;2</subgt;O)、扩增产物稀释液(ddH<subgt;2</subgt;O)或横向流动试纸条中的一种或多种。本发明专利技术主要针对猪链球菌特异性gdh基因和副猪格拉瑟菌特异性infB基因，成功开发双重LAMP‑LFD试剂盒及其检测方法，从而实现猪链球菌病和副猪格拉瑟病病原核酸快速鉴别诊断，为猪链球菌病和副猪格拉瑟病防控提供有效技术支撑。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物检测领域，具体涉及一种基于双重lamp-lfd检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法。

技术介绍

1、猪链球菌(streptococcus suis,ss)和副猪格拉瑟菌(glaesserella parasuis,gps)是感染猪群中常见重要致病菌，其临床症状和病理变化相似，均可引起败血症、多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎和肺炎等。根据荚膜多糖的不同，将猪链球菌分为35个血清型(1～34型和1/2型)，其中1、2、1/2、7、9、14型为猪群中的主要致病血清型，尤以血清2型流行最广，危害最为严重。临床上副猪格拉瑟菌有15个血清型，各地流行菌株血清型不一。近年来，从临床典型病例中可分离出1、2、4、5、6、7、9、12、14型等血清型，但以4、5、12型最为常见，各血清型之间缺乏免疫交叉保护能力。猪链球菌和副猪格拉瑟菌易混合感染，且症状相似临床难以区分，因此，开发灵敏特异的诊断技术，对于疫病防控意义重大。

2、当前针对猪链球菌和副猪格拉瑟菌诊断方法主要包括流行病学、病原分离与鉴定、分子生物学和血清学检测方法。其中病原分离与鉴定操作繁杂，周期长，临床应用少；常规pcr、荧光定量pcr等分子生物学检测方法虽然具有特异性强、灵敏度高等优点，但是所需仪器较为昂贵、需要专业操作人员，也不利于临床现场使用。凝集试验、elisa等血清学检测也存在对实验材料要求高、且无法实现同时检测此两种病原等缺点。

3、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,lam

技术实现思路

1、本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种快速检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的双重lamp-lfd试剂盒及其检测方法，从而实现快速诊断猪链球菌和副猪格拉瑟菌病原，达到及时防控。

2、本专利技术的技术方案为：基于双重lamp-lfd检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的引物组合，包括两组lamp引物，用于扩增猪链球菌的lamp引物为：ss-f3的核苷酸序列如seqidno.1所示；ss-b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；ss-fip的核苷酸序列如seq id no.3所示；ss-bip的核苷酸序列如seq id no.4所示；用于扩增副猪格拉瑟菌的lamp引物为：gps-f3的核苷酸序列如seq id no.5所示；gps-b3的核苷酸序列如seq id no.6所示；gps-fip的核苷酸序列如seq id no.7所示；gps-bip的核苷酸序列如seq idno.8所示。

3、进一步地，所述引物ss-fip的5’端标记有biotin，所述引物ss-bip的5’端标记有6-fa m；所述引物gps-fip的5’端标记有biotin，所述引物gps-bip的5’端标记有digoxigenin。

4、基于双重lamp-lfd检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的引物组合。

5、进一步地，所述试剂盒还包括lamp反应预混液、bst iidna聚合酶、扩增产物稀释液、横向流动试纸条、阴性对照或阳性对照中的一种或多种。

6、非疾病诊断目的基于双重lamp-lfd检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法，包括如下步骤：

7、(1)提取待检测样本的基因组dna；

8、(2)以步骤(1)提取的dna为模板，以上述所述的引物组合进行lamp扩增；

9、(3)将扩增产物加入横向流动试纸条，根据横向流动试纸条信息判断待检测样本是否含有猪链球菌或/和副猪格拉瑟菌。

10、进一步地，所述lamp扩增的反应体系为：模板dna 2μl，权利要求1或2所述的引物组合共1.6μl，2×lamp反应预混液5μl，bst iidna聚合酶2μl、ddh2o 14.4μl；所述lamp扩增的反应程序为：62℃40min。

11、进一步地，所述引物组合的组成为：ss-f30.1μl、ss-b30.1μl、ss-fip 0.2μl、ss-bip 0.2μl、gps-f30.1μl、gps-b30.1μl、gps-fip 0.4μl、gps-bip 0.4μl。

12、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：

13、本专利技术主要针对猪链球菌特异性gdh基因和副猪格拉瑟菌特异性infb基因，成功开发双重lamp-lfd试剂盒及其检测方法，从而实现猪链球菌病和副猪格拉瑟病病原核酸快速鉴别诊断，为猪链球菌病和副猪格拉瑟病防控提供有效技术支撑。

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【技术保护点】

1.基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的引物组合，其特征在于，包括两组LAMP引物，用于扩增猪链球菌的LAMP引物为：SS-F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；SS-B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；SS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；SS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；用于扩增副猪格拉瑟菌的LAMP引物为：GPS-F3的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；GPS-B3的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；GPS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；GPS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物SS-FIP的5’端标记有Biotin，所述引物SS-BIP的5’端标记有6-FAM；所述引物GPS-FIP的5’端标记有Biotin，所述引物GPS-BIP的5’端标记有Digoxigenin。

3.基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括LAMP反应预混液、BstIIDNA聚合酶、扩增产物稀释液、横向流动试纸条、阴性对照或阳性对照中的一种或多种。

5.非疾病诊断目的基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增的反应体系为：模板DNA 2μL，权利要求1或2所述的引物组合共1.6μL，2×LAMP反应预混液5μL，Bst IIDNA聚合酶2μL、ddH2O 14.4μL；所述LAMP扩增的反应程序为：62℃40min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物组合的组成为：SS-F30.1μL、SS-B30.1μL、SS-FIP 0.2μL、SS-BIP 0.2μL、GPS-F30.1μL、GPS-B30.1μL、GPS-FI P 0.4μL、GPS-BIP 0.4μL。

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【技术特征摘要】

1.基于双重lamp-lfd检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的引物组合，其特征在于，包括两组lamp引物，用于扩增猪链球菌的lamp引物为：ss-f3的核苷酸序列如seq id no.1所示；ss-b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；ss-fip的核苷酸序列如seq id no.3所示；ss-bip的核苷酸序列如seq id no.4所示；用于扩增副猪格拉瑟菌的lamp引物为：gps-f3的核苷酸序列如seq id no.5所示；gps-b3的核苷酸序列如seq id no.6所示；gps-fip的核苷酸序列如seq id no.7所示；gps-bip的核苷酸序列如seq id no.8所示。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物ss-fip的5’端标记有biotin，所述引物ss-bip的5’端标记有6-fam；所述引物gps-fip的5’端标记有biotin，所述引物gps-bip的5’端标记有digoxigenin。

3.基于双重lamp-lfd检测猪链球菌和副猪格拉瑟...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱良全，王豪杰，辛凌翔，刘燕，胡云皓，张存帅，李建，姚文生，刘元杰，马欣，赵浩然，王雅茜，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：

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