【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学核酸提取，更具体的涉及一种磁珠法提取血液rna的提取试剂盒及提取方法。
技术介绍
1、现代生物学研究中，rna是理解基因表达模式、调控机制及其对环境变化响应的关键。随着分子生物学和基因组学的快速发展，基因组水平的研究对于遗传发育、流行病检测、病理学机制研究、微生物鉴别诊断等领域都有重要影响，生物学研究对高质量血液rna的需求日益增加。常见的提取血液rna的传统方法主要包括酚氯仿提取法和硫氰酸胍-苯酚提取法等，但这些方法操作过程中需使用有害试剂如苯酚、氯仿或β-巯基乙醇，对实验人员身体健康有害。
2、随着生物技术的不断发展，很多生物技术公司着手rna提取的研究，目前rna提取中常用的试剂盒主要包括trizol试剂一步法、trizol ls试剂一步法和柱膜法，其中前两者均使用苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液，不利于实验人员身体健康且提取的血液rna中含有小片段未降解完全的dna/rna或基因组dna等杂质；后者需要先裂解红细胞，经过离心收集白细胞后进行提取，步骤繁琐复杂，时间多消耗30-120分钟，且只能针对新鲜血液样本进行提取；有些公司也推出了针对非新鲜血液样本直接提取的试剂盒，然而市场上这种试剂盒种类较少，且质量层次不齐。专利cn 114350650 a无dna残留血液rna提取试剂盒及核酸提取方法，该试剂盒包括红细胞裂解液，提取血液rna时需离心除去红细胞使白细胞沉淀后再进行提取，但血液经过冷冻或者存放时间过长会出现溶血现象，这时所有的细胞都发生破裂，无法分离出白细胞，不适用于长期冷冻的血液提取r
3、虽专利cn 114350654 a一种rna提取试剂盒及rna提取方法，可直接对血样样本中的rna进行提取，无需裂解离心分离红细胞，但提取的血液rna中仍然伴有少量基因组dna。因此，研究一种无dna残留且结构完整、纯度高的血液rna提取试剂盒，尤其是能够直接提取冷藏或冷冻血液样本中的rna，具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种磁珠法提取血液rna的提取试剂盒及提取方法，其目的在于发现使用包括1-6m盐酸胍、10-100mm硫脲、10-100mm柠檬酸钠、1-50mm edta、质量浓度为10％-70％的异丙醇、0.1-20mm氯化钠、10-300mm乙酸钠、质量浓度为0.1％-5％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-5％的十二烷基磺酸钠的裂解结合液，结合磁珠无需先裂解红细胞离心收集白细胞沉淀即可直接提取全血样本中rna，且提取的rna产物中无基因组dna和小片段未降解完全dna/rna的残留，由此解决现有市售rna提取试剂盒提取血液rna容易残留基因组dna或混有未降解完全的小片段dna/rna的技术问题。
2、为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种磁珠法提取血液rna的提取试剂盒，其包括裂解结合液和磁珠洗涤液；
3、所述裂解结合液，包括1-6m盐酸胍、10-100mm硫脲、10-100mm柠檬酸钠、1-50mmedta、质量浓度为10％-70％的异丙醇、0.1-20mm氯化钠、10-300mm乙酸钠、质量浓度为0.1％-5％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-5％的十二烷基磺酸钠；
4、所述磁珠洗涤液，包括硅基磁珠以及55％-85％酒精的洗涤液，所述硅基磁珠表面修饰有羟基或羧基，其磁珠粒径为20-400nm，含量为0.5-2mg/ml。
5、优选地，所述磁珠法提取血液rna的提取试剂盒，其提取冷藏或冷冻血液，所述裂解结合液包括1-5m盐酸胍、10-80mm硫脲、10-80mm柠檬酸钠、1-40mm edta、质量浓度为20％-70％的异丙醇、0.1-20mm氯化钠、10-300mm乙酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十二烷基磺酸钠。
6、优选地，所述磁珠法提取血液rna的提取试剂盒，其提取冷藏或冷冻血液，所述磁珠洗涤液包括硅基磁珠以及60％-80％酒精的洗涤液，所述硅基磁珠表面修饰有羟基或羧基，其磁珠粒径为50-400nm，含量为1-2mg/ml。
7、优选地，所述血液rna提取试剂盒，其还包括洗涤液ⅰ，所述洗涤液ⅰ，包括1-4m异硫氰酸胍、1-50mm edta、质量浓度为10％-70％的乙醇和质量浓度为0.5％-10％的np-40。
8、优选地，所述血液rna提取试剂盒，其还包括洗涤液ⅱ、dnaseⅰ、洗脱液中一种或多种。
9、优选地，所述血液rna提取试剂盒，其所述dnaseⅰ，包括但不限于爱博泰克公司、珠海宝锐公司、诺维赞公司、promega公司、neb公司或takara公司市售的dnaseⅰ，其使用量为5-20u/样品。
10、按照本专利技术的另一方面，还提供了一种磁珠法提取血液rna的提取方法，其采用如本专利技术所述血液rna提取试剂盒进行提取。
11、优选地，所述血液rna的提取方法，其包括以下步骤：
12、按照血液样本200-300μl加入裂解结合液300-500μl，室温裂解，待白细胞裂解后加入600-900μl磁珠洗涤液，获得含磁珠-核酸的混合液，并收集混合液中磁珠-核酸；
13、经洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ洗涤后，加入dnase i反应混合液50-100μl，消化除去基因组dna，洗脱液洗脱磁珠获得提取产物rna。
14、优选地，所述血液rna的提取方法，其血液样本为冷冻血液，所述裂解结合液包括1-4m盐酸胍、10-60mm硫脲、10-60mm柠檬酸钠、1-30mm edta、质量浓度为20％-70％的异丙醇、0.1-20mm氯化钠、10-200mm乙酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-3％的十二烷基磺酸钠。
15、优选地，所述血液rna的提取方法，其血液样本为冷藏血液，所述裂解结合液包括包括1-4m盐酸胍、10-60mm硫脲、10-60mm柠檬酸钠、1-20mm edta、质量浓度为20％-70％的异丙醇、0.1-20mm氯化钠、10-200mm乙酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-3％的十二烷基磺酸钠。
16、总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于本专利技术提供的血液rna提取试剂盒，能够取得下列有益效果：
17、本专利技术提供的血液rna提取试剂盒，包括裂解结合液和磁珠洗涤液，其中裂解结合液中的阴离子表面活性剂(十六烷基肌氨酸钠和十二烷基磺酸钠)能够裂解细胞和溶解细胞膜，使rna和dna释放出来，而裂解结合液中的乙酸钠和异丙醇能够协同显著促进rna沉淀，利于rna与dna分离，同时乙酸钠可以增加溶液中rna的负电荷密度，利于rna与表面修饰羟基或羧基的硅基磁珠特异性结合；另外，盐酸胍、edta、硫脲和胍盐共同作用抑制rna酶的活性，可防止rna降解，利于从富含rnase的血液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磁珠法提取血液RNA的提取试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液和磁珠洗涤液；
2.如权利要求1所述的磁珠法提取血液RNA的提取试剂盒，其特征在于，提取冷藏或冷冻血液，所述裂解结合液包括1-5M盐酸胍、10-80mM硫脲、10-80mM柠檬酸钠、1-40mM EDTA、质量浓度为20％-70％的异丙醇、0.1-20mM氯化钠、10-300mM乙酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十二烷基磺酸钠。
3.如权利要求1或2所述的磁珠法提取血液RNA的提取试剂盒，其特征在于，提取冷藏或冷冻血液，所述磁珠洗涤液包括硅基磁珠以及60％-80％酒精的洗涤液，所述硅基磁珠表面修饰有羟基或羧基，其磁珠粒径为50-400nm，含量为1-2mg/mL。
4.如权利要求1至3任意一项所述的血液RNA提取试剂盒，其特征在于，还包括洗涤液Ⅰ，所述洗涤液Ⅰ，包括1-4M异硫氰酸胍、1-50mM EDTA、质量浓度为10％-70％的乙醇和质量浓度为0.5％-10％的NP-40。
5.如权利要求4所述的血液RNA提取试剂盒
6.如权利要求5所述的血液RNA提取试剂盒，其特征在于，所述DNaseⅠ，包括但不限于爱博泰克公司、珠海宝锐公司、诺维赞公司、Promega公司、NEB公司或Takara公司市售的DNaseⅠ，其使用量为5-20U/样品。
7.一种磁珠法提取血液RNA的提取方法，其特征在于，采用如权利要求1至6任意一项所述血液RNA提取试剂盒进行提取。
8.如权利要求7所述的血液RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的血液RNA的提取方法，其特征在于，血液样本为冷冻血液，所述裂解结合液包括1-4M盐酸胍、10-60mM硫脲、10-60mM柠檬酸钠、1-30mM EDTA、质量浓度为20％-70％的异丙醇、0.1-20mM氯化钠、10-200mM乙酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-3％的十二烷基磺酸钠。
10.如权利要求8所述的血液RNA的提取方法，其特征在于，血液样本为冷藏血液，所述裂解结合液包括包括1-4M盐酸胍、10-60mM硫脲、10-60mM柠檬酸钠、1-20mM EDTA、质量浓度为20％-70％的异丙醇、0.1-20mM氯化钠、10-200mM乙酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-3％的十二烷基磺酸钠。
...【技术特征摘要】
1.一种磁珠法提取血液rna的提取试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液和磁珠洗涤液；
2.如权利要求1所述的磁珠法提取血液rna的提取试剂盒，其特征在于，提取冷藏或冷冻血液，所述裂解结合液包括1-5m盐酸胍、10-80mm硫脲、10-80mm柠檬酸钠、1-40mm edta、质量浓度为20％-70％的异丙醇、0.1-20mm氯化钠、10-300mm乙酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十六烷基肌氨酸钠、质量浓度为0.1％-4％的十二烷基磺酸钠。
3.如权利要求1或2所述的磁珠法提取血液rna的提取试剂盒，其特征在于，提取冷藏或冷冻血液，所述磁珠洗涤液包括硅基磁珠以及60％-80％酒精的洗涤液，所述硅基磁珠表面修饰有羟基或羧基，其磁珠粒径为50-400nm，含量为1-2mg/ml。
4.如权利要求1至3任意一项所述的血液rna提取试剂盒，其特征在于，还包括洗涤液ⅰ，所述洗涤液ⅰ，包括1-4m异硫氰酸胍、1-50mm edta、质量浓度为10％-70％的乙醇和质量浓度为0.5％-10％的np-40。
5.如权利要求4所述的血液rna提取试剂盒，其特征在于，还包括洗涤液ⅱ、dnaseⅰ、洗脱液中一种或多种。
6.如权利要求5所述的血液rna提取试剂盒，...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭元媛，晋莲，郭仁康，潘超，宋建军，
申请(专利权)人：武汉纳磁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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