一种BstDNA聚合酶活性的检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种Bst DNA聚合酶活性检测方法及其试剂盒，其包括以下步骤：利用Bst DNA聚合酶进行等温扩增，绘制Bst DNA聚合酶标准品酶量与扩增产物双链DNA对应的扩增曲线线性增长期内单位时间最大荧光增量的标准曲线，通过检测Bst DNA聚合酶待测样品扩增产物在线性增长期内单位时间最大荧光增量，根据标准曲线计算待测样品的酶活。该检测方法绘制的标准曲线为线性曲线，R2在0.99以上，检测酶活范围更广，而且在检测酶活在10

【技术实现步骤摘要】
一种Bst DNA聚合酶活性的检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，更具体地，涉及一种Bst DNA聚合酶活性的检测方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]嗜热脂肪地芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus，Bst)DNA聚合酶是DNA聚合酶A家族的成员之一，Bst DNA聚合酶全长基因为2634bp，表达的蛋白为878个氨基酸，对应分子量为98k Da。而Bst DNA聚合酶的大片段像Klenow大片段DNA聚合酶一样具有5
′→3′
DNA聚合酶活性，但不具有5
′→3′
外切核酸酶活性，失去了N端292个氨基酸，基因长度为1758bp，编码蛋白长度为586个氨基酸，对应分子量为67k Da。由于其具有较强的热稳定性、链置换活性以及聚合酶活性，被广泛应用于环介导等温扩增(Loop
‑
Mediated Isothermal Amplification，LAMP)。
[0003]在LAMP等温扩增方法中，Bst DNA聚合酶以双链环状质粒DNA为模板，在等温条件和扩增引物的作用下实现快速、高效的扩增，不需要进行模板的预变性，进而减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，具有操作简单、特异性强、产物易检测等优点。另外，Bst DNA聚合酶还可用于富含GC序列的DNA序列测定；亦可用于微量(纳克量)DNA模板的快速测序。在医学检测、病原微生物的检验检疫、食品检疫等各个领域有着重要的作用。因此准确标定Bst DNA聚合酶的活性，保证各个批次间酶活性的稳定，具有十分重要的意义。
[0004]现有的Bst DNA聚合酶活性测定通常采用同位素法，即在Bst DNA聚合酶的反应体系和条件下，依赖于被放射性元素3H标记的核苷酸的掺入，合成带有放射性同位素标记的核苷酸链，进而通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出酶的活性。但是此种方法易产生放射性污染，且需要进行沉淀、洗涤、干燥等多个步骤，检测周期长、难以实现高通量、自动化、给Bst DNA聚合酶的筛选带来了困难。
[0005]专利CN114561444A提供了Bst DNA聚合酶活性检测方法，其原理是Bst DNA聚合酶的活性在一定范围内与双链DNA产物的量呈正比，而双链DNA产物的量与反应体系中的焦磷酸呈正比，因此可以用焦磷酸试剂盒荧光强度来测定其活性。该方法虽然在一定程度上克服了同位素法的缺点，但是需要在等温扩增反应结束后加入焦磷酸检测试剂，利用酶标仪来测出相应的信号进行计算，过程相对繁琐，且成本较高。除此外，该方法绘制的标准曲线呈S曲线并非线性正相关，即随着酶活性增加焦磷酸含量呈现先增加后趋于平衡，可见，使用该检测方法检测的酶活适用范围有限，尤其是在检测酶活性较高的样品时，检测准确性较差。因此，研究一种使用性广且准确性高的Bst DNA聚合酶活性检测方法具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种Bst DNA聚合酶活性检
测方法及其试剂盒，其目的在于发现双链DNA扩增产物在线性增长期内单位时间最大荧光增量与酶量呈线性正相关，通过绘制线性标准曲线快速测定Bst DNA聚合酶活性，由此解决现有Bst DNA聚合酶活性检测方法绘制标准曲线为S曲线，检测范围较小且高酶活样品检测准确性较差的技术问题。
[0007]为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种Bst DNA聚合酶活性检测方法，其包括以下步骤：
[0008]利用Bst DNA聚合酶进行等温扩增，绘制Bst DNA聚合酶标准品与扩增产物双链DNA对应的扩增曲线线性增长期内单位时间最大荧光增量的标准曲线，通过检测Bst DNA聚合酶待测样品扩增产物在线性增长期内单位时间最大荧光增量，根据标准曲线计算待测样品的酶活。
[0009]优选地，所述Bst DNA聚合酶活性检测方法，其所述单位时间为等温扩增反应单次循环所需的时间。
[0010]优选地，所述Bst DNA聚合酶活性检测方法，其所述等温扩增，扩增引物为一组等温扩增引物。
[0011]优选地，所述Bst DNA聚合酶活性检测方法，其所述扩增引物，包括但不局限于如SEQ ID No.1
‑
6所示序列在内的所有常规等温扩增引物组。
[0012]优选地，所述Bst DNA聚合酶活性检测方法，其所述扩增引物，序列如SEQ ID No.1
‑
6所示。
[0013]优选地，所述Bst DNA聚合酶活性检测方法，其所述等温扩增，其模板双链环状质粒DNA，包括但不局限于如SEQ ID No.7所示序列在内的所有对应如本专利技术中常规等温扩增引物组中任一组引物组的产物或模板序列。
[0014]优选地，所述Bst DNA聚合酶活性检测方法，其所述等温扩增，其模板双链环状质粒DNA如SEQ ID No.7所示序列。
[0015]优选地，所述Bst DNA聚合酶活性检测方法，其所述最大荧光增量采用荧光染料法实时荧光定量扩增获得。
[0016]优选地，所述Bst DNA聚合酶活性检测方法，其扩增反应条件为65℃，15～60秒，60个循环；85℃，5分钟。
[0017]按照本专利技术的另一方面，还提供了一种Bst DNA聚合酶活性检测试剂盒，其包括酶浓度在5～80U/μL的Bst DNA聚合酶标准品。
[0018]总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于发现双链DNA扩增产物在线性增长期内单位时间最大荧光增量与酶量呈线性正相关，能够取得下列有益效果：
[0019]本专利技术提供的Bst DNA聚合酶活性检测方法，通过绘制Bst DNA聚合酶标准品与扩增产物双链DNA对应的扩增曲线线性增长期内单位时间最大荧光增量的标准曲线，能够快速测定待测样品的酶活性。由于绘制的标准曲线呈线性，使用范围更广，尤其是检测酶活性在10～80U的样品，准确性高。
附图说明
[0020]图1为本专利技术的酶活检测方法的原理示意图；
[0021]图2为本专利技术的检测方法获得的酶用量
‑
最大荧光值增量标准曲线图。
具体实施方式
[0022]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0023]现有研究表明，通过测定等温扩增产物双链DNA的副产物焦磷酸根含量，绘制标准曲线可以快速测定Bst DNA聚合酶活性，但是该检测方法获得的标准曲线为S曲线，随着酶活性增加焦磷酸含量呈现先增加后趋于平衡，尤其是当酶量达到16U时，焦磷酸含量趋于平衡，可见，该检测方法检测范围有限，尤其是在检测酶活在16U/μL以上样品时，其检测结果准确本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Bst DNA聚合酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：利用Bst DNA聚合酶进行等温扩增，绘制Bst DNA聚合酶标准品酶量与扩增产物双链DNA对应的扩增曲线线性增长期内单位时间最大荧光增量的标准曲线，通过检测Bst DNA聚合酶待测样品扩增产物在线性增长期内单位时间最大荧光增量，根据标准曲线计算待测样品的酶活。2.如权利要求1所述的Bst DNA聚合酶活性检测方法，其特征在于，所述单位时间为等温扩增反应单次循环所需的时间。3.如权利要求2所述的Bst DNA聚合酶活性检测方法，其特征在于，所述等温扩增，扩增引物为一组等温扩增引物。4.如权利要求3所述的Bst DNA聚合酶活性检测方法，其特征在于，所述扩增引物，包括但不局限于如SEQ ID No.1
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6所示序列在内的所有常规等温扩增引物组。5.如权利要求4所述的Bst DNA聚合酶活性检测方法，其特征在于，所述扩增引物，序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：马耀争，晋莲，钟芳林，潘超，杨小岚，蒋如飞，
申请(专利权)人：武汉纳磁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：