一种增强己糖激酶酶活性的方法技术

本发明专利技术属体外诊断技术领域，具体来说是提供了一种增强己糖激酶酶活性的方法，其特征是，在含有己糖激酶的液体试剂中添加N

【技术实现步骤摘要】
一种增强己糖激酶酶活性的方法


[0001]本专利技术属体外诊断领域，具体来说是一种增强己糖激酶酶活性的方法和相应的己糖激酶活性增强剂。

技术介绍

[0002]己糖激酶(Hexokinase, EC 2.7.1.1)是六碳糖的磷酸化酶，己糖激酶通过磷酸化葡萄糖激活糖酵解，该步骤是葡萄糖代谢的限速步骤，因此在调节人体内健康葡萄糖水平中具有非常重要的作用。己糖激酶催化葡萄糖和ATP发生磷酸化反应，生成葡萄糖
‑6‑
磷酸(G
‑6‑
P)与ADP，使葡萄糖从稳定状态变为活跃状态。。
[0003]目前，己糖激酶在体外诊断领域已经有多项应用：（1）用于血清葡萄糖测定试剂，己糖激酶法是目前血糖检测的公认参考方法，该方法的原理是，利用己糖激酶催化葡萄糖和ATP发生磷酸化反应，生成G
‑6‑
P，G
‑6‑
P在葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶(G6PDH)催化下脱氢，同时使NADP
+
还原成NADPH，NADPH的生成速率与葡萄糖浓度呈正比，在波长340nm监测吸光度升高速率，或通过与标准品比对，计算血清样本中葡萄糖浓度；（2）用于血清1,5
‑
脱水
‑
D
‑
山梨醇(1,5
‑
AG)测定试剂，1,5
‑
AG检测关键步骤使用的吡喃糖氧化酶会同时反应葡萄糖和1,5
‑
AG，因此需要使用己糖激酶联合丙酮酸激酶预先消除血清样本中的葡萄糖，在利用吡喃糖氧化酶通过Trinder
’
s反应测定样本中的1,5
‑
AG含量；己糖激酶与葡萄糖结合时，需要发生构象变化，然而这种构象变化会被反应终产物葡萄糖
‑6‑
磷酸所抑制，将导致己糖激酶酶活性随着反应的进行而降低，这一特性在糖代谢的调节中起着重要的作用。在应用在酶法体外诊断试剂中，这一特性会造成反应速率降低，消除葡萄糖干扰能力不足等问题，目前，只通过在试剂中加入更多的己糖激酶原料来解决，进一步增加了生产成本。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种己糖激酶的活性增强剂，能用于血清葡萄糖测定试剂盒、血清1,5
‑
脱水山梨醇测定试剂盒，达到增加检测试剂线性范围、增强试剂盒抗干扰能力的作用。
[0005]本专利技术的具体内容如下：在含有己糖激酶的液体试剂中添加N
‑
甲基
‑
3,4
‑
二甲氧基苄胺和3,4
‑
二甲氧基苯乙醇中的一种，其添加量为0.01
‑
0.03wt%。
附图说明
[0006]图1是增强剂对己糖激酶活性影响。
[0007]图2是含有增强剂的血清葡萄糖测定试剂测定标准品的反应曲线。
[0008]图3是含有增强剂的血清葡萄糖测定试剂测定高浓度样本的反应曲线。
实施方式
[0009]需要说明的是，以下实施例中所述内容并不限制本专利技术的专利范围，凡是利用本专利技术说明书所做等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关
，均同理包括在本专利技术的专利保护范围内。若无特殊说明，以下实施例中所使用的化学品均购自萨恩化学技术(上海)有限公司；酶原料采购自深圳市迈博生物科技有限公司。
[0010]实施例一：己糖激酶活性测定方法按以下步骤测定己糖激酶活性：（1）按以下配方配制反应溶液50 mM Tris
‑
HCl pH 8.010 mM 葡萄糖2 mM ATP1 mM NADP
+
10 mM MgCl210U/ml 葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶；（2）按以下配方配制酶稀释液10 mM Tris
‑
HCl pH 8.00.9 wt% NaCl0.01% Tween
‑
200.03% 牛血清白蛋白；（3）用步骤（2）中配制的酶稀释液将己糖激酶冻干粉溶解，并稀释至50ug/ml；（4）取两份3ml步骤（1）中配制的反应溶液分别加入至2个石英比色皿中，在25℃孵育3min，一份加入50ul步骤（3）中配制的己糖激酶酶溶液，另一份加入50ul步骤（2）所配制的酶稀释液作为空白对照；（5）将2个比色皿在25℃孵育300s，并记录340 nm吸光度变化，按以下公式计算己糖激酶酶活性：
[0011]6.22：NADPH在340nm波长的摩尔消光系数（cm2/micromole）；t：反应时间（min）；3.05：总反应体积（ml）；0.05：样本体积（ml）；x：酶浓度（mg/ml）。
[0012]实施例二：N
‑
甲基
‑
3,4
‑
二甲氧基苄胺和3,4
‑
二甲氧基苯乙醇对己糖激酶活性影响
[0013]在实施例一中所述的己糖激酶活性测定反应液中加入不同含量的N
‑
甲基
‑
3,4
‑
二甲氧基苄胺和3,4
‑
二甲氧基苯乙醇，并使用这些反应液按实施例一中的方案测定己糖激酶酶活性，结果如图1所所示。
[0014]可以看出，N
‑
甲基
‑
3,4
‑
二甲氧基苄胺和3,4
‑
二甲氧基苯乙醇对己糖激酶活性均
有增强作用，在浓度为0.01wt%时就能起到较好的活性增效果，N
‑
甲基
‑
3,4
‑
二甲氧基苄胺和3,4
‑
二甲氧基苯乙醇使用最佳浓度分别为0.015wt%和0.02wt%。
[0015]实施例三：N
‑
甲基
‑
3,4
‑
二甲氧基苄胺和3,4
‑
二甲氧基苯乙醇用于血清葡萄糖测定试剂（1）按以下配方配制葡萄糖检测R1试剂50 mM Tris
‑
HCl pH 7.60.9% NaCl4.5 mM MgCl20.02wt% Tween
‑
20（2）按以下配方配制葡萄糖检测R1试剂30 mM Tris
‑
HCl pH 7.60.9% NaCl5 mM ATP2 mM NADP
+
15U/ml 己糖激酶20U/ml 葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶
[0016]将R1试剂分为三份，一份加入N
‑
甲基
‑
3,4
‑
二甲氧基苄胺0.02wt%，一份加入3,4
‑
二甲氧基苯乙醇0.025wt，最后一份作为对照品，使用上述试剂在全自动生化仪上，按照R1:R2:S=180:60:10测定15mM的葡萄糖标准品和35mM的葡萄糖样本，其反应曲线分别如图2和图3所示。
[0017]可以看本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强己糖激酶酶活性的方法，其特征是，在含有己糖激酶的液体试剂中添加N
‑
甲基
‑
3,4
‑
二甲氧基苄胺和3,4
‑
二甲氧基苯乙醇中的一种。2.如权利要求1中所述的增强己糖激酶酶活...

【专利技术属性】
技术研发人员：张远，张伯平，刘佳龙，谢芳，
申请(专利权)人：深圳市安帝宝科技有限公司，
类型：发明
国别省市：