11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术属体外诊断技术领域，具体提供了一种11‑脱氢血栓烷B

【技术实现步骤摘要】
11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法
本专利技术属体外诊断领域，具体来说是一种11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒，以及上述试剂盒的制备方法。
技术介绍
11-脱氢血栓烷B2(11-dhTXB2)是血栓素A2(血栓素B2)在人体尿液中的最终代谢产物，尿液中的11-脱氢血栓烷B2含量可以精准反映一定时间范围内血液中血栓素A2的水平，而人体血液内血栓素A2水平与血小板聚集能力密切相关。所以，人体尿液中11-脱氢血栓烷B2的含量可作为血小板凝集能力的判定指标之一。该检测项目对抗血小板凝集治疗效果的确认，尤其是阿司匹林耐药性检测具有重要意义。另外，对于心脑血管疾病患者，该指标可在一定程度上能反映其心梗、卒中等发病概率，进而帮助医生及时更换用药和改变治疗策略。11-脱氢血栓烷B2为小分子化合物，在尿液中含量较低，且尿液成分复杂、干扰物极多，所以对人体尿液11-脱氢血栓烷B2含量进行定量检测较为困难，常规的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、酶联免疫分析法(ELISA)、放射免疫法(RIA)等，但是这些方法具有一定的局限性，例如需要人工操作、需要专门的仪器设备、材料过于昂贵、检测周期较长等，使该检测项目无法在临床上进行大规模推广应用。随着近年来全球心脑血管疾病发病率的持续增加，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的11-脱氢血栓烷B2测定试剂盒具有极高的市场价值。均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对11-脱氢血栓烷B2的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，能有效满足日益增长的临床检测需求。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的缺陷，本专利技术提供一种11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒，可以实现在全自动生化分析仪上对人体尿液11-脱氢血栓烷B2进行高通量、快速化的定量检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还极大的降低了11-脱氢血栓烷B2的检测成本，有利于临床推广使用。具体来说，本专利技术提供的检测试剂盒由样本稀释液、标准品、质控品和检测试剂组成。样本稀释液为一定浓度和pH的缓冲液，可选缓冲体系包括Tris-HCl、碳酸钠-盐酸、硼酸-硼砂、甘氨酸-NaOH，优选Tris-HCl和硼酸-硼砂；其浓度为5-50mM；其pH值范围为8.0-9.5。标准品为浓度在4000~8000pg/ml范围内的11-脱氢血栓烷B2甲酸溶液。质控品为添加了防腐剂的人体尿液，其中11-脱氢血栓烷B2的浓度由高效液相色谱法(HPLC)确定。检测试剂由两个独立的液体试剂组成，并按照使用顺序分为R1和R2，主要成分为11-脱氢血栓烷B2特异性抗体、酶标偶联物、酶底物、显色物质，溶解在含有Mg2+的缓冲液中。在检测试剂中，11-脱氢血栓烷B2特异性抗体抗体和酶标偶联物彼此独立，酶标偶联物和酶底物彼此独立，可选的成分组合如下所述，优选为组合三：组合一：R1：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM、显色物质5~25mM；R2：酶标偶联物0.05~10ug/ml组合二：R1：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM；R2：酶标偶联物0.05~10ug/ml、显色物质5~25mM组合三：R1：酶标偶联物0.05~10ug/ml；R2：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM、显色物质5~25mM组合四：R1：酶标偶联物0.05~10ug/ml、显色物质5~25mM；R2：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM所述的11-脱氢血栓烷B2特异性抗体是由11-脱氢血栓烷B2免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与11-脱氢血栓烷B2特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述的酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2经化学合成的半抗原酶标偶联物；所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的底物，可选的有葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸钠盐，优选葡萄糖-6-磷酸钠盐；所述的显色物质可选的有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，以及它们的钠盐，优选为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐；所述的含有Mg2+的缓冲液可选的有甘氨酸-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、TAPS缓冲液，优选为Tris-HCl缓冲液，其pH值优选范围为8.0~9.0，其中Mg2+浓度为0.2~30mM，优选为2~10mM。本专利技术还包括上述试剂盒中所使用的酶标偶联物，即葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2的半抗原偶联物及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：（1）将10~50mg11-脱氢血栓烷B2用二甲基亚砜(DMSO)配置成5~10mg/ml的溶液，加入4~20mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再加入6~30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在20℃震荡反应3~5小时，用DMSO稀释至1mg/ml(以11-脱氢血栓烷B2含量计)，放置于4℃终止反应，并保存于4℃；（2）称取5～25mg的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，用含有2mMMg2+的TAPS缓冲液配置成1mg/ml的溶液；（3）将步骤（1）与（2）所制得的溶液按一定比例混合，并在20℃震荡反应12h，所混合的比例在1:30~1:300内，优选的比例为1:50~1:200，更优选的比例为1:100~1:150；（4）通过凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物。附图说明图1试剂盒测定的标准曲线。图2试剂盒相关性分析图。具体实施方式需要说明的是，以下实施例中所述内容并不限制本专利技术的专利范围，凡是利用本专利技术说明书所做等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关
，均同理包括在本专利技术的专利保护范围内。实施例一：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2偶联物的制备按以下步骤制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2偶联物：（1）将20mg11-脱氢血栓烷B2溶解于4ml二甲基亚砜（DMSO）中，加入8mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌完全溶解，再加入12mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，密闭并在20℃震荡反应4小时，再向混合物中加入16mlDMSO，精准定容至20ml，按1ml/瓶分装20瓶，在4℃保存；（2）称取100mg的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，用95ml含有2mMMg2+的TAPS缓冲液配置成1mg/ml的溶液，调节pH至8.3，定容至100ml；（3）将步骤（1）与步骤（2）所制得的溶液按1：100比例混合，并在20℃震荡避光反应12h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种11-脱氢血栓烷B

【技术特征摘要】
1.一种11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于：试剂盒含有11-脱氢血栓烷B2特异性抗体和酶标偶联物，所述的酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与11-脱氢血栓烷B2的偶联物。


2.根据权利要求[1]所述的11-脱氢血栓烷B2均相酶免疫检测试剂盒由以下部分组成：
(1)样本稀释液：一定浓度和pH的缓冲液，可选缓冲体系包括Tris-HCl、碳酸钠-盐酸、硼酸-硼砂、甘氨酸-NaOH，优选Tris-HCl和硼酸-硼砂；其浓度为5-50mM；其pH值范围为8.0-9.5；
(2)标准品：11-脱氢血栓烷B2甲酸溶液，浓度在4000~8000pg/ml范围内；
(3)质控品：添加了防腐剂的人体尿液，11-脱氢血栓烷B2的浓度由高效液相色谱法(HPLC)确定；
(4)检测试剂：分为R1和R2两个单独的液体试剂，特征是含有11-脱氢血栓烷B2特异性抗体、酶标偶联物、酶底物、显色物质，溶解在含有Mg2+的缓冲液中，且11-脱氢血栓烷B2特异性抗体抗体和酶标偶联物彼此独立，酶标偶联物和酶底物彼此独立，采用以下组合的一种，优选使用组合三：
组合一：
R1：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM、显色物质5~25mM；R2：酶标偶联物0.05~10ug/ml；
组合二：
R1：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM；R2：酶标偶联物0.05~10ug/ml、显色物质5~25mM；
组合三：
R1：酶标偶联物0.05~10ug/ml；R2：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM、显色物质5~25mM；
组合四：
R1：酶标偶联物0.05~10ug/ml、显色物质5~25mM；R2：11-脱氢血栓烷B2特异性抗体0.05~10ug/ml、酶底物5~25mM；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳龙，张远，张伯平，蔡泽浪，
申请(专利权)人：深圳市安帝宝科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44