本发明专利技术公开了一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括：包被单抗YFV‑M5的微孔反应板、样品处理液、结合有标记物的单抗YFV‑M12、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液。该试剂盒能特异性的检测黄热病毒抗原，与其他黄病毒属病毒抗原无交叉反应，检测黄病毒培养上清敏感度同商品化荧光定量PCR检测试剂盒类似。
【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒
本专利技术涉及医药领域，具体涉及一种医用配制品，特别涉及一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒。
技术介绍
黄热病毒(YFV)是以伊蚊为媒介在虫媒传染病毒，与登革病毒、西尼罗河病毒、乙脑病毒、寨卡病毒等同属黄病毒属，可致严重危害人健康的黄热病。当前主要流行于非洲和南美洲的热带、亚热带地区。近年来，由于旅游、商贸等交流增多，黄热病的传播再趋活跃，非疫区人员赴黄热病疫区而感染并死亡的病例时有报道。2016年以来我国已报道多例输入性黄热病病例。当前，黄热病在我国无爆发流行，但华南地区同黄热病毒流行地区具有类似气候、有害媒介及其人群对黄热病毒普遍易感。因此，我国输入性黄热病毒传播流行的潜在威胁不容忽视。控制其输入性传播的关键环节之一是研制高效、特异的实验室检测方法，对感染患者进行早期诊断、隔离。目前黄热病毒感染的实验室诊断方法主要包括病毒分离、核酸检测、抗原检测和血清学检测等。其中病毒分离是黄热病毒感染诊断和血清型鉴定的金标准，但该方法费时而且对于实验室的条件要求较高。尽管病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏、更快速，但分子诊断操作相对复杂，对设备和人员要求较高，并较易发生污染导致假阳性结果，同时由于毒株的变异、潜在突变等序列改变也可能引起假阴性结果。而IgM往往在感染病毒后5-6天才开始出现，IgG在感染病毒后14天出现，不能实现快速检测，同时黄热病毒疫苗株广泛使用、黄病毒属病毒间交叉反应，导致血清学方法不能准确区分是否是由于疫苗使用或其它黄病毒感染。同时当前黄热病毒各种商品化诊断试剂并不普及。因此，建立一种简便易行的能够特异性黄热病毒感染的早期诊断试剂盒势在必行。黄热病毒的非结构蛋白1(nonstructuralprotein1，NS1)是一种相对保守的糖蛋白，有膜型和分泌型两种形式，在感染细胞中高度表达，具有很强的抗原性，且研究发现在黄热病毒感染患者或感染动物的早期血中存在高浓度的NS1循环抗原，因此检测急性期病人血清中的分泌型NS1抗原可用于早期诊断黄热病毒感染。通过基于黄热病毒NS1的抗原捕获ELISA法来检测黄热病毒的方法可分为两类，一类是以多克隆抗体的为捕获抗体或检测抗体，这类方法在不同批次的抗血清中存在很大差异，难以重复和实现实验室的标准化。另一类利用NS1的单克隆抗体来检测黄热病毒，当前尚无利用抗NS1的单克隆抗体来检测黄病毒的商品化试剂盒。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒。本专利技术所要解决的技术问题提供一种具有高灵敏度和特异性的黄热病毒NS1抗原免疫诊断试剂盒，它可直接检测到血液标本中的YFVNS1抗原，实现黄热病毒感染的早期诊断。为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒是基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液组成，其特征在于所述的捕获抗体为单抗YFV-M5，由保藏号为CGMCC-19393的杂交瘤细胞株YFV-M5分泌得到；所述的检测抗体为单抗YFV-M12，由保藏号为CGMCC-19394的杂交瘤细胞株YFV-M12分泌得到。杂交瘤细胞株YFV-M5(分类命名为SP2/0杂交瘤细胞株)和杂交瘤细胞株YFV-M12(分类命名为SP2/0杂交瘤细胞株)，分别于2020年3月16号在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏登记号分别为CGMCC-19393和CGMCC-19394。本专利技术试剂盒中，所述的单抗YFV-M5和单抗YFV-M12均是IgG1亚类的免疫球蛋白，两种单抗均能特异性结合黄热病毒。所述的杂交瘤细胞株YFV-M5和YFV-M12是用重组的YFVNS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫Balb/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，最后用HAT培养基筛选得到。本专利技术试剂盒中，所述的标记物是指能标记在抗体的非活性部位且可定量分析的物质，例如酶；而相应的显色液则含有能与所述标记物反应并产生颜色变化的物质，例如酶的底物。这些都是本领域的常识，本领域技术人员可根据这些常识轻易地选定标记物与相应的显色液，如辣根过氧化物酶及其底物过氧化氢尿素和四甲基联苯胺(简称TMB)就是ELISA试验中常用的标记物及显色液组合，也同样适用于本专利技术。所述的样品处理液、浓缩洗液和终止液均是双抗体夹心ELISA方法中的常用试剂，所述的阳性对照物是指黄热病毒NS1蛋白，所述的阴性对照物是不含黄热病毒NS1蛋白的空白对照物。本专利技术试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，其中所述的捕获抗体YFV-M5和检测抗体YFV-M12是从一组抗黄热病毒NS1蛋白的单克隆抗体中筛选出来的，仅能特异性结合黄热病毒，因此该试剂盒能够准确、快速地检测出黄热病毒，而同其它黄病毒属病毒如登革病毒、西尼罗河病毒以及乙型脑炎病毒均无交叉反应，且对黄热病毒具有很高的敏感度，同商品化黄热病毒核酸检测试剂盒(上海之江)具有类似的敏感度，有利于黄热病毒的早期诊断和治疗。同时，该试剂盒成本低，主要试剂均以工作液形式提供操作简便，能同时快速检测大批样品，能够有效的用于黄热病毒疫情中疑似患者初筛和日常虫媒中病毒监测。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术提供了一种检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒能特异性的检测黄热病毒抗原，与其他黄病毒属病毒抗原无交叉反应，检测黄病毒培养上清敏感度同商品化荧光定量PCR检测试剂盒类似。附图说明图1为YFV-NS1重组蛋白的诱导表达图；图2为免疫印记检测YFV单抗YFV-M5与各重组黄病毒属病毒NS1蛋白反应结果图；图3为免疫荧光法检测代表性的YFV单抗YFV-M5与黄病毒属病毒感染细胞免疫反应结果图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的具体实施作进一步说明，但本专利技术的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。1、所述的单抗YFV-M5和YFVM-12的制备方法和鉴定结果：(1)免疫抗原的制备本专利技术用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组YFVNS1蛋白和已灭活天然的病毒抗原。基因重组YFVNS1蛋白是用一种携带YFVNS1基因的工程菌株制备的，其制备按常规方法进行，经用镍-次氮基三醋酸金属亲和层析的方法进行纯化获得NS1抗原。将NS1蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂定量。Westernblot对纯化的重组蛋白鉴定结果显示，小鼠抗hisMAb在分子量约46KDa处出现特异性的反应条带，与预测的YFVNS1分子量大小一致(如图1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性检测黄热病毒 NS1 抗原的免疫诊断试剂盒，包括用于包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液；其特征在于，所述捕获抗体为YFV-M5，由保藏号为CGMCC NO ：19393的杂交瘤细胞株 YFV-M5分泌得到；所述的检测抗体为YFV-M12，由保藏号为CGMCC NO ：19394的杂交瘤细胞株YFV-M12分泌得到。/n
【技术特征摘要】
1.一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，包括用于包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液；其特征在于，所述捕获抗体为YFV-M5，由保藏号为CGMCCNO：19393的杂交瘤细胞株YFV-M5分泌得到；所述的检测抗体为YFV-M12，由保藏号为CGMCCNO：19394的杂交瘤细胞株YFV-M12分泌得到。
2.根据权利要求1所述的特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1所述的特异性...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈月，任瑞文，刘乐斌，陈荣华，刘军，张锦海，余楠，刘朵朵，
申请(专利权)人：中国人民解放军南部战区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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