一种位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽及其应用。本发明专利技术从登革病毒（dengue virus，DENV）非结构蛋白1（nostructal protein1，NS1）序列中筛选出一条具有高反应性的抗原多肽，进行重组表达。经过试验验证，该多肽能够对登革病毒感染病人血清中IgM具有较高的反应性。本发明专利技术的抗原表位多肽在DENV感染早期诊断和流行病学调查中有巨大的潜在价值。

【技术实现步骤摘要】
一种位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽及其应用
本专利技术涉及登革病毒的抗原表位多肽，具体涉及一种位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽及其应用。
技术介绍
由登革病毒（Denguevirus，DENV）所致的登革热是热带和亚热带国家主要的公共卫生问题，在我国南方地区，特别是东南沿海各省几乎每年均发生登革热流行。DENV属于黄病毒科黄病毒属，黄病毒属家族成员还包括黄热病病毒（yellowfevervirus，YFV）、西尼罗河病毒（WestNilevirus，WNV）、日本脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）和蜱传播热病毒（tick-borneencephalitisvirus，TBEV）等。DENV具有I～IV血清型（DENV-1、-2、-3和-4）。任何一型DENV感染均可表现为无症状或引起轻微的自限性疾病（登革热，denguefever，DF）以及以自发性出血为特征的严重疾病（登革出血热，denguehemorrhagicfever，DHF）或更为严重的以循环衰竭为特征的登革休克综合症（dengueshocksyndrome，DSS）。当前人类对登革热的防治面临着许多难题，没有特异性的治疗药物，没有安全有效的疫苗，但及时采取临床救治措施可以大大减少DHF/DSS的发病率和死亡率，由于多数DENV感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、寒战等流感样症状，难以跟其它发热疾病和出血热疾病区分，必须依赖实验室的诊断加以确认。ELISA、胶体金等血清学诊断方法操作较为简单，且已在基层卫生部门广泛应用，具有较高的应用价值。然而，由于黄病毒属病毒间抗体具有广泛的交叉反应性，难以区分是黄病毒属疫苗接种的结果还是病毒感染结果，在那些存在多种黄病毒流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难，解决这一问题的关键在于高质量抗原的筛选。筛选DENV特异性抗原可为我国登革热的临床诊断、血清学监测和流行病学调查提供新的技术手段，相关研究具有显著的针对性和实用性。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽及其应用。本专利技术的目的是提供一个同登革病毒感染病人血清中IgM具有高反应性抗原。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种位于DENVNS1蛋白DENV特异性抗原表位多肽其氨基酸残基序列为HLGKLEL(M/I)DF，该抗原能够同DENV感染病人血清中DENV特异性的IgM具有高反应性。本专利技术提供的一种位于登革病毒（DENV）非结构蛋白1（NS1）抗原表位多肽，其氨基酸序列如下所示：269-HLGKLELDF-277。一种蛋白质，包含所述位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽的氨基酸序列。这种蛋白质也可以是由以上多肽中的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸残基的取代或添加而形成的、具有与以上多肽相同或相似功能的多肽或蛋白质分子。一种多聚体，包含所述位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽的氨基酸序列。本专利技术提供的位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽在制备DENV抗体检测试剂中的应用。本专利技术提供的蛋白质在制备DENV抗体检测试剂中的应用。本专利技术提供的多聚体在制备DENV抗体检测试剂中的应用。所述DENV抗体检测试剂用于检测登革病毒感染所致登革热、登革出血热和登革出血综合征等疾病。本专利技术解决上述问题的技术方案如下所述。采用生物信息学和重叠多肽方法筛选出具有高反应性多肽片段，合成基因重组表达，反复验证其同DENV感染病人血清中DENV特异性的IgM反应性，得到肽段NS269-277，其氨基酸残基序列为HLGKLELDF。本专利技术的目的是通过这样的技术方案实现的。合成一组覆盖DENV-1NS1的重叠20肽多肽，验证其同DENV感染病人血清中IgM的反应性，筛选得到一条阳性多肽NS261-280。对黄病毒属病毒NS1蛋白序列进行生物信息学分析，发现阳性多肽中存在登革病毒特异性的保守9肽序列HLGKLEL(M/I)DF，再次采用重叠多肽筛选方法的DENV特异性的共同序列和抗原表位，发现感染病人血清同HLGKLEL(M/I)DF反应（L替换为M/I后不影响其反应性）。合成以上多肽基因后重组表达。为更好的展示该表位，构建该多肽的多聚体肽段（肽段间以G-G-G-S-S-G-G-G连接），发现其多肽聚体同登革病毒感染血清有很好的反应性。因为筛选得到目的多肽只有9个氨基酸残基，并以该序列为模板设计引物，人工合成的方法合成基因，酶切插入载体中诱导表达。该方法可根据需要获得相应序列的基因，同时也可选择在大肠杆菌的偏性密码子合成目的基因，有利于在E.coli中获得高效的表达，这是以NS1基因为模板的普通PCR法不能达到的。对多肽的基因可先合成两条3’端有一段互补重叠的基因片段，将二者返火后用聚合酶延伸，获得正负双链DNA基因。构建多聚体时为了便于基因间的相互连接，并在连接后可获得较好的抗原活性，在抗原表位间需有一连接臂，在表位的上下游分别加上G-G-G-S和S-G-G-G,所以在合成基因时应加上相应的基因。最后为了便于基因克隆到表达载体，还合成了两条和连接臂相配的通用引物，引入XBal和Xhol酶切位点，以适合表达载体pBVIL1（由军事医学科学院惠赠，参见中国专利申请：表达载体pBVIL1及其构建方法和用途，授权号200810000021.8）。构建的表达质粒需测序鉴定，以证明基因片段已获得正确的插入。多聚体融合抗原表达质粒是在NS269抗原表达质粒的基础上构建而成的。把其中一个含NS269基因的质粒作为载体，另一含有基因含NS269基因的质粒作为模板，用含有SpeI的通用引物及含有BamHI的原IL-1基因3’端引物，扩增出含有NS269基因和部分IL-1的基因片段，插入用Xhol和XBal双切的NS269基因基因的后面，获得含有2聚体NS269基因的质粒。由于新质粒中，两个NS269基因基因间的连接是由互补酶XBal和SpeI之间的相连，连接后酶切位点不复存在，因此，新质粒又可作为新的载体，与另一含有NS269基因质粒的扩增基因片段连接。重复3次，可获得质粒pBVIL1/+三聚体NS269基因。转化、诱导、表达后，获得纯化的NS269三聚体片段融合抗原。抗原表达质粒转化E.coliHB101后，通过热诱导培养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明表达质粒获得高效的表达，再经过交换柱及凝胶过滤纯化获得电泳纯的DENV抗原纯品。实验结果证明，本专利技术的DENV抗原同DENV1感染病人血清中IgM具有很高的交叉反应性，同时同DENV-1/DENV-2/DENV-3/DENV-4小鼠腹水具有反应，表明该抗原是能够用于检测DENV特异性IgM的抗原。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术提供的位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽是一条具有高反应性的抗原多肽，经过试验验证，该多肽能够对登革病毒感染病人血清中IgM具有较高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽，其特征在于，氨基酸序列如下所示：269- HLGKLELDF-277。/n

【技术特征摘要】
1.一种位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽，其特征在于，氨基酸序列如下所示：269-HLGKLELDF-277。


2.一种蛋白质，其特征在于，包含权利要求1所述位于登革病毒非结构蛋白1抗原表位多肽的氨基酸序列。


3.一种多聚体，其特征在于，包含权利要求1所述位于登革病毒非结...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈月，任瑞文，刘乐斌，陈荣华，刘军，张锦海，余楠，刘朵朵，
申请(专利权)人：中国人民解放军南部战区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44