本发明专利技术公开了一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括：包被单抗CHIKV‑M2的微孔反应板、样品处理液、结合有标记物的单抗CHIKV‑M10、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液。该试剂盒能特异性检测基孔肯雅病毒抗原，与其他虫媒病毒抗原无交叉反应，检测基孔肯雅病毒培养上清敏感度同商品化荧光定量PCR检测试剂盒类似。
【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒
本专利技术涉及医药领域，具体涉及一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒。
技术介绍
基孔肯雅病毒(chikungnyavirus，CHIKV)属披膜病毒科甲病毒属，是一种单股正链RNA虫媒病毒，主要传播媒介为伊蚊。可致基孔肯雅热，主要临床表现为突发高热，寒战，皮疹，关节剧烈疼痛等，部分患者转变为慢性感染，表现迁延不愈的多发性关节炎，致使感染人群丧失劳动力，从而导致严重的社会与经济损失。该病毒主要流行于非洲、南美洲、南亚和东南亚等地区，流行区域逐年增大。我国云南也是基孔肯雅病的自然疫源地，近年已发现多起输入性病例。当前我国人群普遍对CHIKV免疫力低下，而其与登革病毒(denguevirus，DV)具有相同的传播媒介伊蚊，因此，很容易发生输入性基孔肯雅病流行，在2010年我国广东省东莞和阳江报道输入性基孔肯雅热本地暴发疫情。当前基肯雅病毒无批准的疫苗，也没有特异性的治疗性药物，虫媒控制是控制基孔肯雅病毒传播最有效的手段。同时在缺少疫苗的情况下，必须对传染病进行监测，以便早期发现早期隔离；为了达到此目的，我国已建立了积极的虫媒病毒监测计划，在虫媒传染病高发季节对发热的情况和传播虫媒进行监测，并对发热且怀疑被虫媒病毒感染的个体进行血清学和病毒学的筛选。基孔肯雅病毒所致疾病与登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒等所致的病毒性出血热症状相似，十分容易误诊。目前，存在数种诊断基孔肯雅病毒感染的检验方法。不过，为了获得可判断的结果，必须将数种方法结合起来。<br>病毒分离，通过敏感细胞分离或在乳鼠颅内接种或蚊虫接种等，具有如下缺点：对操作者和实验室条件要求高，依赖于早期取样及良好的保存条件；此外，耗时久，至少一周。RT/PCR检验法具有快速、敏感性和可靠性，是当前主要的诊断基孔肯雅病毒感染方法。但是同病毒分离方法类似，对操作者和实验室条件要求较高。血清学抗体(IgM和IgG)检测也是实验室诊断CHIKV感染最常用的方法，发病3至6d后可检测到IgM，在发病3d后患者中IgM阳性率约为4％到20％，在发病1周后阳性率达到80％以上，持续存在1到3个月。而在发病6到7d后检测到IgG，通常在检测到IgM后1-2d后即可检测到IgG，IgG存在时间可达数年。单独检测急性期血清IgM和检测急性期和恢复期双份血清中IgG，比较前后IgG滴度升高4倍以上可以用于确诊CHIKV感染。对于慢性CHIKV感染患者，由于急性期病人未及时就诊，而病情持续数月后转为慢性感染，此时病毒RNA和IgM近似于消失，检测IgG或血清中和实验(neutralizationtest，NT)是其确诊的唯一方法。ELISA检测抗体的优点在于它成本低、易操作和对人员设备要求低，适用于初筛和基层医疗机构。其缺点是虫媒病毒间存在交叉表位，易与其他虫媒病毒发生交叉反应而产生假阳性结果。抗原检测是CHIKV感染的另一种诊断方法。基孔肯雅病毒基因组长度约为11kb，编码5种结构蛋白(capsid，envelopeprotein3，envelopeprotein2，6K，envelopeprotein1；C，E3，E2，6K，E1)和4种非结构蛋白(nonstructuralprotein1-4，NSP1-4)。NSP1蛋白同病毒复制有关，在病毒感染细胞早期能够检测到该蛋白，同时本实验室在感染白纹伊蚊中也检测到该蛋白，提示该蛋白可作为诊断基孔肯雅病毒感染的抗原靶标。因此，本专利技术提供一种可靠、快速和低成本的基孔肯雅病毒感染的早期抗原检测方法，有效用于病毒感染早期诊断和虫媒监测。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒。本专利技术所要解决的技术问题提供一种具有高灵敏度和特异性的基孔肯雅病毒NSP1抗原免疫诊断试剂盒，它可直接检测到血液或蚊虫标本中的CHIKVNSP1抗原，实现基孔肯雅病毒感染的早期诊断和虫媒监控。本专利技术的目的至少通过如下技术方案之一实现。为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒是基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液组成，其特征在于所述的捕获抗体为单抗CHIKV-M2，由保藏号为CGMCC-19391的杂交瘤细胞株CHIKV-M2(命名为SP2/0杂交瘤细胞株)分泌得到；所述的检测抗体为单抗CHIKV-M10，由保藏号为CGMCC-19392的杂交瘤细胞株CHIKV-M10(命名为SP2/0杂交瘤细胞株)分泌得到。本专利技术试剂盒中，所述的单抗CHIKV-M2是IgG1亚类的免疫球蛋白,CHIKV-M10是IgG2a亚类的免疫球蛋白，两种单抗均能特异性结合基孔肯雅病毒。所述的杂交瘤细胞株CHIKV-M2和单抗CHIKV-M10是用重组的CHIKVNSP1蛋白和天然的NSP1蛋白交叉免疫Balb/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，最后用HAT培养基筛选得到。本专利技术试剂盒中，所述的标记物是指能标记在抗体的非活性部位且可定量分析的物质，例如辣根过氧化物酶、胶体金、碱性磷酸酶、生物素等；而相应的显色液则含有能与所述标记物反应并产生颜色变化的物质。这些都是本领域的常识，本领域技术人员可根据这些常识轻易地选定标记物与相应的显色液，如辣根过氧化物酶及其底物过氧化氢尿素和四甲基联苯胺(简称TMB)就是ELISA试验中常用的标记物及显色液组合，也同样适用于本专利技术。所述的样品处理液、浓缩洗液和终止液均是双抗体夹心ELISA方法中的常用试剂，所述的阳性对照物是指基孔肯雅病毒NSP1蛋白，所述的阴性对照物是不含基孔肯雅病毒NSP1蛋白的空白对照物。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术提供的试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，其中所述捕获抗体CHIKV-M2和检测抗体CHIKV-M10是从一组抗基孔肯雅病毒NSP1蛋白的单克隆抗体中筛选出来的，仅能特异性结合基孔肯雅病毒，因此该试剂盒能够准确、快速地检测出基孔肯雅病毒，而同其它虫媒病毒如辛德毕斯病毒、登革病毒、西尼罗河病毒以及乙型脑炎病毒均无交叉反应，且对基孔肯雅病毒具有很高的敏感度，可检测病毒滴度低5×104TCID50/ml，有利于基孔肯雅病毒的早期诊断和虫媒监控。附图说明图1为CHIKV-NSP1重组蛋白的诱导表达图；图2为免疫荧光法检测代表性的CHIKVNSP1单抗CHIKV-M2与常见虫媒病毒感染细胞免疫反应结果图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的具体实施作进一步说明，但本专利技术的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性检测基孔肯雅病毒 NSP1 抗原的免疫诊断试剂盒，包括：用于包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液；其特征在于，所述捕获抗体为CHIKV-M2，由保藏号为 CGMCC NO ：19391 的杂交瘤细胞株CHIKV-M2分泌得到；所述的检测抗体为CHIKV-M10，由保藏号为CGMCC NO ：19392 的杂交瘤细胞株CHIKV-M10分泌得到。/n
【技术特征摘要】
1.一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒，包括：用于包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液；其特征在于，所述捕获抗体为CHIKV-M2，由保藏号为CGMCCNO：19391的杂交瘤细胞株CHIKV-M2分泌得到；所述的检测抗体为CHIKV-M10，由保藏号为CGMCCNO：19392的杂交瘤细胞株CHIKV-M10分泌得到。
【专利技术属性】
技术研发人员：陈月，任瑞文，刘乐斌，陈荣华，刘军，张锦海，
申请(专利权)人：中国人民解放军南部战区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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