黄热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了黄热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法与应用。该杂交瘤细胞株YFVMcAb

【技术实现步骤摘要】
黄热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及细胞工程
，具体涉及黄热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]黄热病毒(Yellow Fever virus，YFV)是黄病毒科黄病毒属的单链正链RNA病毒，直径大小为22
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38nm，基因组全长约为11kb，包括东非型、西非型、南美洲I型和南美洲II型4个基因亚型。黄热病是一种通过伊蚊、血蜱等节肢动物传播给人类及非人灵长类动物的急性虫媒传染病，其临床表现主要为发热、黄疸、出血，感染严重时可造成死亡，主要流行于非洲和南美洲等热带地区，每年可造成29000
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60000人死亡，是较为严重的虫媒传染病毒之一。
[0003]黄热病首先通过商业往来从非洲传播入南美洲，并以埃及伊蚊为传播媒介在美洲部分城市中流行，可导致急性出血热病的爆发。1928年，流行于巴西里约热内卢的最后一场有记录的城市黄热病利用杀虫剂滴滴涕得到有效控制，并在20世纪50年代，一场密集的根除运动消灭了巴西的埃及伊蚊和其他可传播黄热病毒的伊蚊。但在20世纪70年代，埃及伊蚊的重新出现给巴西再次带来了黄热病毒在森林领域的传播，并逐步向森林之外的地区蔓延开来；2016年底，巴西米纳斯吉拉斯州出现大规模黄热病流行，具有森林传播模式城市化的可能性。虽然此次的发病人数因黄热疫苗的预防有明显的降低，但黄热病毒的主要传播媒介(埃及伊蚊和白纹伊蚊)的存在从未停止并已在美洲整个大陆蔓延开来，且数量越来越多。这也预示着黄热病毒很有可能随着伊蚊分布地区的扩增、全球气候的变化以及旅游业的全球性发展而出现新的流行区，此情况在欧洲城、北美和亚洲都有类似的报道。
[0004]由于黄热病毒感染后普遍为轻症，另外再加上杀虫剂对传播媒介的清除以及黄热病毒疫苗的预防，使得该病毒在之前并未被重视。然而，全国各地蚊虫杀虫剂的大量使用让蚊虫对其产生了不同程度的抗性，这对黄热病毒传播的控制是极其不利的，尽管研究人员不断探讨蚊虫对杀虫剂药物抗性相关基因突变的相关知识，但对于蚊虫极强大的繁殖、传播能力以及难以准确定位的基因突变情况而言，要彻底消灭所有的传播媒介几乎是无法完成的任务。另外，随着全球气候变暖以及旅游业的大规模发展，伊蚊的分布地区越来越广泛，人类跨国交往的频率也越来越高，这使得黄热病向我国输入的可能性不断提升。
[0005]目前全国对于黄热病的重视程度在不断提高，专家们已研制出很多黄热病毒的诊断方法，包括：病毒分离法、核酸杂交法和纳米金层析免疫法等。但以上检测方法在追求方便、快捷和高效的过程中都不可避免的存在一些还需要深入探究来不断优化的缺点，比如实验操作繁琐复杂、仪器设备要求较高等。目前关于黄热病毒的主要检测方法—qRT
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PCR法并不太适用黄热病毒流行地区的快速自我筛查，而对于黄热病毒的中和抗体快速检测方法的研发仍未完成。本研究所得到的单克隆抗体效价高、特异性强，且具有显著中和作用的单抗，为黄热病毒中和抗体检测方法的建立提供实验室基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术所解决的技术问题在于克服上述现有技术的不足，提供一种黄热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株YFVMcAb
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11及其单克隆抗体，能够用于黄热病毒进行包括ELISA(酶联免疫吸附剂检测)、间接免疫荧光以及中和作用检测在内的生物诊断，本专利技术提供的单克隆抗体还可用于黄热病的治疗。
[0007]本专利技术的第一方面是提供一种黄热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株YFVMcAb
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11，该细胞株于2014年4月23日在中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏编号为CCTCCNO:C202377。
[0008]本专利技术的第二方面是提供一种黄热病毒单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C202377的杂交瘤细胞株YFVMcAb
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11分泌产生。本专利技术的黄热病毒单克隆抗体是用乳鼠鼠脑扩增黄热病毒后稀释于PBS中作为抗原免疫BALB/C小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株YFVMcAb
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11，杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1型。
[0009]本专利技术的第三方面是提供如本专利技术第二方面所述的黄热病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010](1)采用黄热病毒17D株对小鼠进行免疫，获得免疫后的小鼠；
[0011](2)取免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，融合后细胞经HAT选择培养基进行选择性培养，采用间接免疫荧光法筛选阳性克隆，用有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养直至克隆化细胞抗体阳性率100％，得到杂交瘤细胞株。
[0012](3)将步骤(2)获得的杂交瘤细胞株移入小鼠腹腔培养，收集腹水，用亲和层析法获得纯化的单克隆抗体。
[0013]本专利技术的第四方面是提供如本专利技术第二方面所述的黄热病毒单克隆抗体或本专利技术第三方面所述的制备方法制备得到的单克隆抗体在制备检测黄热病毒试剂中的应用。
[0014]本专利技术的第五方面是提供一种检测黄热病毒的试剂，所述试剂包括如本专利技术第二方面所述的黄热病毒单克隆抗体或本专利技术第三方面所述的制备方法制备得到的单克隆抗体。
[0015]本专利技术的第六方面是提供如本专利技术第二方面所述的黄热病毒单克隆抗体或本专利技术第三方面所述的制备方法制备得到的单克隆抗体在制备黄热病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。
[0016]本专利技术的第七方面是提供一种黄热病诊断和/或预后判断的试剂，所述试剂包括如本专利技术第二方面所述的黄热病毒单克隆抗体或本专利技术第三方面所述的制备方法制备得到的单克隆抗体。
[0017]本专利技术的第八方面是提供如本专利技术第二方面所述的黄热病毒单克隆抗体或本专利技术第三方面所述的制备方法制备得到的单克隆抗体在制备治疗黄热病的制剂中的应用。
[0018]优选的，所述制剂包括冻干制剂或液体制剂。
[0019]优选的，所述制剂包括注射用制剂或口服制剂。
[0020]本专利技术的第九方面是提供一种用于治疗黄热病的生物制剂，所述制剂包括如本专利技术第二方面所述的黄热病毒单克隆抗体或本专利技术第三方面所述的制备方法制备得到的单克隆抗体。
[0021]本专利技术是通过如下具体方法获得上述黄热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株YFVMcAb
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11及其单克隆抗体：
[0022](1)病毒扩增
[0023]黄热病毒17D株稀释于DMEM培养基后注入3日龄乳鼠鼠脑中进行扩增，200μL/只。注射后，每日观察乳鼠生存情况，待乳鼠有拒乳、侧卧、离群等现象时，无菌条件下取鼠脑于1
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PBS中研磨稀释后离心取上清以得到病毒悬液。
[0024](2)免疫小鼠
[0025]以制备好的病毒悬液免疫6
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8周龄雄性BALB/c小鼠。
[0026]第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株YFVMcAb
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11，其特征在于，该杂交瘤细胞株YFVMcAb
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11保藏编号为CCTCC NO:C202377。2.一种黄热病毒单克隆抗体，其特征在在于，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C202377的杂交瘤细胞株YFVMcAb
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11分泌产生。3.一种如权利要求2所述的黄热病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用黄热病毒17D株对小鼠进行免疫，获得免疫后的小鼠；(2)取免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，融合后细胞经HAT选择培养基进行选择性培养，采用间接免疫荧光法筛选阳性克隆，用有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养直至克隆化细胞抗体阳性率100％，得到杂交瘤细胞株。(3)将步骤(2)获得的杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔培养，收集腹水，用亲和层析法获得纯化的黄热病毒单克隆抗体。4.权利要求2所述的一种黄热病毒单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘纪茹，李春缘，任瑞文，胡潇予，刘炅，徐晓立，田靖，袁子国，
申请(专利权)人：中国人民解放军南部战区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：