一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。本发明专利技术将编码COE蛋白的基因克隆至真核表达载体pPIC9K中后，转化入毕赤酵母GS115感受态细胞进行诱导表达，成功表达得到了重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白。该COE蛋白的纯化生产工艺较原核表达包涵体抗原简便易行，且COE蛋白的表达量高、纯度高，更接近病毒蛋白天然结构；利用该COE蛋白作为包被抗原，成功构建了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒，该方法及其试剂盒的检测结果准确度高、特异性强、敏感性高、重复性好，且该试剂盒所需要的样品量少，操作简便快捷，成本低；因此，该方法及其试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒抗体中具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒
本专利技术属于动物疫病检测
更具体地，涉及一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。
技术介绍
猪流行性腹泻病(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由冠状病毒猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种急性传染病，发病猪以呕吐、水样腹泻、脱水以及哺乳仔猪高致死率为主要特征。该病最初于20世纪70年代报道于英国和比利时(Oldham，1972)，随后包括中国、日本、韩国等在内的多个亚洲国家也先后报道本病的发生，频繁爆发，并导致严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒(PEDV)是单链正股RNA病毒，在遗传分类上属于冠状病毒科、冠状病毒属。其基因组共编码4种主要结构蛋白，即核衣壳蛋白(N)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和纤突蛋白(S)；其中，位于病毒颗粒表面的S蛋白具有比其他任何PEDV蛋白更强的抗原性。S蛋白在介导病毒粒子进入细胞和诱导机体产生中和抗体的过程中起到关键作用，并且在感染病毒的猪中持续检测到的S蛋白的抗体比N蛋白的抗体时间更长。因S蛋白富含许多抗原表位，是PEDV感染免疫研究和疫苗设计的主要靶蛋白，该蛋白抗体水平及其变化动态是评价免疫效果和监测免疫状态的重要依据，同时也可以作为PEDV感染血清流行病学调查的重要指标。S蛋白由1383个氨基酸组成，与其他冠状病毒一样，它可分为两个功能区即S1区(1～789aa)和S2区(790～1383aa)；其中，位于S1区的COE蛋白(499～638aa)被证实具有很好的免疫原性，是重要的中和表位，而基于COE蛋白的研究多聚焦于疫苗开发。现有技术中，关于PEDV抗体的血清学检测已被广泛应用，以评估猪场的PEDV疫苗情况或染病猪的血清学诊断。与其他现有的血清学方法相比较，如荧光微球免疫测定(FMIA)、血清中和测试(SN)、间接免疫荧光测定(IFA)和酶联免疫吸附实验(ELISA)是一种更加便捷、快速且经济的方法，使其适用于临床诊断。迄今为止，已经有两种类型的ELISA用于检测针对PEDV的抗体，包括间接ELISA和竞争性或封闭ELISA。基于完整病毒制品或重组病毒蛋白已经开发了间接ELISA；但是，由于全病毒培养费时，昂贵且不适合大规模生产；因此，使用异源表达系统获得重组PEDV蛋白成为研究趋势。目前，基于PEDV的M蛋白、N蛋白、S蛋白和ORF3蛋白及PEDV全病毒的ELISA诊断试剂盒都已有报道；但是，蛋白抗原尤其是S蛋白抗原的制备主要基于原核表达系统进行表达纯化，其表达产物不能有效模拟病毒蛋白天然构象，相对费时费力，且表达量低、纯度和特异性较低。因此，开发一种简便快速、检测特异性强、敏感性高、准确度高、重复性好的PEDV抗体的检测方法以及能够商品化生产的试剂盒具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有PEDV抗体检测方法的缺陷和不足，提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。本专利技术的目的是提供重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体和/或制备检测重组猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒中的应用。本专利技术另一目的是提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法。本专利技术又一目的是提供一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒。本专利技术再一目的是提供所述方法或所述试剂盒在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体中的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体和/或制备检测重组猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒中的应用。所述COE蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示，编码所述COE蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示。优选地，所述COE蛋白的制备方法为：将编码所述COE蛋白的基因克隆至真核表达载体pPIC9K中，将获得的重组表达质粒pPIC9K-COE转化入毕赤酵母GS115感受态细胞进行诱导表达，即得所述COE蛋白。优选地，所述检测的方法为ELISA法。更优选地，所述检测的方法为间接ELISA法。本专利技术还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，以重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白为包被抗原，利用ELISA法进行检测。优选地，所述检测方法包括以下步骤：S1.以重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白为包被抗原用包被液包被酶标板，并封闭微孔表面未吸附位点；S2.将待测猪血清稀释后加入酶标板的孔中，同时设置空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔，待测猪血清中的抗体与酶标板中的包被抗原进行反应，洗去反应后未结合的物质；S3.加入酶标二抗反应，洗去反应后未结合的酶标二抗，然后加入底物显色液进行显色后，用终止液终止反应，根据测得的OD450值计算阴阳性临界值；S4.当阴阳性临界值≥0.12时，则待测猪血清为猪流行性腹泻病毒抗体阳性；当阴阳性临界值＜0.12，则待测猪血清为猪流行性腹泻病毒抗体阴性。所述阴阳性临界值的计算公式为：阴阳性临界值＝(待检样品的平均OD450值-阴性对照平均OD450值)/(阳性对照平均OD450值-阴性对照平均OD450值)。优选地，步骤S1所述包被液为0.05MTris。优选地，步骤S1所述重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白包被的浓度为1μg/mL。优选地，步骤S1所述包被的条件为4℃包被11～13h。更优选地，步骤S1所述包被抗原包被酶标板的条件为4℃包被12h。优选地，步骤S2所述稀释的倍数为400倍。优选地，步骤S2所述反应的条件为36～38℃反应40～50min。更优选地，步骤S2所述反应的条件为37℃反应45min。优选地，步骤S3所述酶标二抗反应条件为36～38℃反应25～35min。更优选地，步骤S3所述酶标二抗反应条件为37℃反应30min。优选地，步骤S1所述封闭的条件为36～38℃封闭60min。更优选地，步骤S1所述封闭的条件为37℃封闭60min。优选地，步骤S3所述酶标二抗稀释倍数为10000。本专利技术还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，包括由重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白包被的酶标板。优选地，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG抗体。更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、血清样品稀释液、浓缩洗涤液、底物缓冲液、底物液和终止液。具体优选地，所述试剂盒包括以下组分：(1)酶标板：酶标板孔内包被有重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白，并封闭微孔表面未吸附位点；(2)酶标记物：1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG抗体；(3)阳性对照血清：PEDV高免本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体和/或制备检测重组猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白在检测重组猪流行性腹泻病毒抗体和/或制备检测重组猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述COE蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示，编码所述COE蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述COE蛋白的制备方法为：将编码所述COE蛋白的基因克隆至真核表达载体pPIC9K中，将获得的重组表达质粒pPIC9K-COE转化入毕赤酵母GS115感受态细胞进行诱导表达，即得所述COE蛋白。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测的方法为ELISA法。


5.一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，以重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白为包被抗原，利用ELISA法进行检测。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.以重组猪流行性腹泻病毒COE蛋白为包被抗原用包被液包被酶标板，并封闭微孔表面未吸附位点；
S2.将待测猪血清稀释后加入酶标板的孔中，同时设置空白对...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弘，李莉萍，杨金易，肖治理，苏晓娜，李家冬，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44