一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其制备方法和应用。寡聚蛋白体包括猪瘟病毒囊膜蛋白分子和外源寡聚化结构片段，猪瘟病毒囊膜蛋白分子选自猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子、猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子，猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子与外源寡聚化结构片段形成E2寡聚蛋白体，猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子与外源寡聚化结构片段形成E0寡聚蛋白体。将E2、E0寡聚蛋白体作为疫苗抗原，不含任何猪瘟病毒的遗传物质RNA，生产和使用均安全。E2及E0寡聚蛋白体中的各囊膜蛋白保持其天然结构及生物活性，做为疫苗抗原免疫效果显著；寡聚蛋白体将抗原的多个亚单位蛋白聚合在一起，克服了亚单位蛋白疫苗的弱点，疫苗免疫原性显著提高，且抗原含量高，容易生产和纯化。

A kind of CSFV envelope protein oligomer and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物工程及病毒疫苗
，尤其涉及猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0寡聚蛋白体及其制备方法、包含有猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0寡聚蛋白体的新型疫苗，以及在制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂中的应用。
技术介绍
猪瘟(ClassicSwineFever，CSF)是由猪瘟病毒(ClassicSwineFeverVirus，CSFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，目前可分为急性、亚急性、慢性和非典型猪瘟。急性猪瘟由强毒株引发，一般导致猪的高发病率和高死亡率。除引起败血症外，猪瘟病毒还可引起一系列临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸形、慢性营养消耗、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统病变，并容易继发和并发细菌或其他病毒感染。猪瘟给世界养猪业造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疫病名录(OIE-listeddiseases)，为须申报的(Notifiable)动物传染病，我国也将其列为一类动物传染病。猪瘟病毒为黄病毒科瘟病毒属成员，病毒粒子呈球形，是有囊膜的单股正链RNA病毒。基因组全长12.3kb，含有一个大的开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，该阅读框编码一个含3898个氨基酸的多聚蛋白，此多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用下，加工形成4个结构蛋白(C、E0、E1和E2)和8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中囊膜糖蛋白E0和E2是两个保护性抗原蛋白，可以诱导机体产生抗猪瘟的保护性免疫抗体。近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势，且现代猪瘟的流行趋势发生了很大变化，呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存，隐性感染和持续感染并现，免疫失败的现象亦时有发生。这种新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战，加上用传统弱毒疫苗免疫动物后，无法区分被野毒感染与主动免疫的动物(DifferentiatingInfectedfromVaccinatedAnimals，DIVA)，已经不能满足现代防控和根除猪瘟的要求了。因此，研制安全、高效且具有DIVA特性的新型猪瘟疫苗对于预防和控制该病具有重要意义。虽然近年来研制的新型猪瘟疫苗具有各自的优势，但也存在一定的缺陷。如核酸疫苗诱导产生抗体的速度慢，接种剂量大，有整合和转化染色体的潜在危险；病毒活载体疫苗对人类而言，因还不完全了解病毒的自然发生及变异机制，无法控制该类病毒的未来走向；亚单位疫苗免疫原性通常要比病毒颗粒抗原差，不能提供有效保护；基因缺失疫苗通常为弱毒活苗，其长期使用可能会改变猪瘟病毒原有的生态环境和病毒群落，使猪瘟流行毒株向远离疫苗毒的方向演化，且很难达到现代防控和根除猪瘟疫病的要求。寡聚蛋白体，也叫多聚蛋白质或多亚基蛋白体，是指由两个或两个以上亚基蛋白组成的蛋白体。与单亚基蛋白质相比，寡聚蛋白体的分子体积大，多亚基协同，能产生变构效应以利于细胞识别和功能调节，可以做为理想的疫苗抗原。鉴于此，本专利技术提供一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其疫苗，克服传统疫苗的不足，弥补其它基因工程疫苗的缺憾，从而有效提高疫苗的免疫原性。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述不足，本专利技术提供了猪瘟病毒囊膜蛋白E2、E0寡聚蛋白体及其制备方法、包含有猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0寡聚蛋白体的新型疫苗，以及在制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一个目的是提供一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，包括猪瘟病毒囊膜蛋白分子和外源寡聚化结构片段；所述猪瘟病毒囊膜蛋白分子选自猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子、猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子中的任一种；所述猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子与外源寡聚化结构片段形成E2寡聚蛋白体，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子与外源寡聚化结构片段形成E0寡聚蛋白体。进一步地，所述E2寡聚蛋白体是由2个、3个或4个外源寡聚化结构片段分别对应地将2个、3个或4个E2蛋白分子链接成E2二聚蛋白体、E2三聚蛋白体或E2四聚蛋白体。进一步地，所述E0寡聚蛋白体是由2个、3个或4个外源寡聚化结构片段分别对应地将2个、3个或4个E0蛋白分子链接成E0二聚蛋白体、E0三聚蛋白体或E0四聚蛋白体。更进一步地，所述外源寡聚化结构片段选自西尼罗病毒C蛋白寡聚化结构片段WNV-Alpha4、酵母转录因子GCN4中的任一种。进一步地，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0和猪瘟病毒囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒所有基因亚型毒株。更进一步地，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0和猪瘟病毒囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒2.1基因亚型株。本专利技术的第二个目的是提供上述任一项所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的制备方法，包括如下步骤：(1)人工合成寡聚蛋白体的单个融合亚基多肽基因，并将该基因克隆至质粒载体，获得猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的重组表达质粒载体；所述单个融合亚基多肽基因包括亚基多肽、G6S9短肽链接、外源寡聚化结构片段及组氨酸标签短肽；(2)将所述猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收宿主细胞培养上清液，提取纯化猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体。进一步地，所述质粒载体选自昆虫杆状病毒质粒、哺乳细胞表达系统质粒、细菌表达系统质粒、酵母表达系统质粒中的任一种。进一步地，所述宿主细胞选自昆虫细胞、哺乳细胞、大肠杆菌细胞，酵母细胞中的任一种。本专利技术的第三个目的是提供一种疫苗，所述疫苗包括上述任一项所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，所述寡聚蛋白体选自E2寡聚蛋白体、E0寡聚蛋白体中的一种或两种。进一步地，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自水包油包水型佐剂、水包白油型佐剂、角鲨烯佐剂、植物油佐剂、纳米佐剂或弗氏佐剂中的至少一种。本专利技术的第四个目的是提供上述任一项所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体在制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂中的应用，所述制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒中的任一种。寡聚蛋白体是指由两个或两个以上亚基蛋白组成的蛋白体，与单亚基蛋白质相比，寡聚蛋白体的分子体积大，多亚基协同能产生变构效应以利于细胞识别和功能调节，可以做为理想的疫苗抗原。因此，与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术通过重组载体表达得到带有特别聚合功能的寡聚化结构片段、G6S9短肽链接及猪瘟病毒囊膜蛋白E2或囊膜蛋白E0的融合大分子，后者再自组装成E2寡聚蛋白体或E0寡聚蛋白体；将E2及E0寡聚蛋白体用于制备疫苗，由于不含任何猪瘟病毒的遗传物质RNA，因而生产和使用均安全；同时，抗原性好，抗体效价高，保护效果明显，适用范围广，可作为标记疫苗使用，符合我国政府进行猪瘟净化的战略要求，具有较好的实际应用价值。(2)本专利技术通过构建的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体重组质粒转染宿主细胞，得到细胞培养液，回收并纯化细胞培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，其特征在于，包括猪瘟病毒囊膜蛋白分子和外源寡聚化结构片段；所述猪瘟病毒囊膜蛋白分子选自猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子、猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子中的任一种；所述猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子与外源寡聚化结构片段形成E2寡聚蛋白体，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子与外源寡聚化结构片段形成E0寡聚蛋白体。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，其特征在于，包括猪瘟病毒囊膜蛋白分子和外源寡聚化结构片段；所述猪瘟病毒囊膜蛋白分子选自猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子、猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子中的任一种；所述猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子与外源寡聚化结构片段形成E2寡聚蛋白体，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子与外源寡聚化结构片段形成E0寡聚蛋白体。


2.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，其特征在于，所述E2寡聚蛋白体是由2个、3个或4个外源寡聚化结构片段分别对应地将2个、3个或4个E2蛋白分子链接成E2二聚蛋白体、E2三聚蛋白体或E2四聚蛋白体。


3.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，其特征在于，所述E0寡聚蛋白体是由2个、3个或4个外源寡聚化结构片段分别对应地将2个、3个或4个E0蛋白分子链接成E0二聚蛋白体、E0三聚蛋白体或E0四聚蛋白体。


4.根据权利要求1-3任一项所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，其特征在于，所述外源寡聚化结构片段选自西尼罗病毒C蛋白寡聚化结构片段WNV-Alpha4、酵母转录因子GCN4中的任一种。


5.根据权利要求1所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，其特征在于，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0和猪瘟病毒囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒所有基因亚型毒株。


6.根据权利要求5所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，其特征在于，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0和猪瘟病毒囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒2.1基因亚型株。


7.权利要求1-6任一项所述的猪瘟病...

【专利技术属性】
技术研发人员：许雁，诺曼·吉利卡，李改，夏燕，
申请(专利权)人：诺华生物科技武汉有限责任公司，许雁，
类型：发明
国别省市：湖北;42