一种用于灭活重组杆状病毒的方法技术

本发明专利技术公开一种用于灭活重组杆状病毒的方法，该方法为使所述重组杆状病毒接触过氧化氢进行灭活。使用过氧化氢作为灭活剂，能有效地灭活重组杆状病毒，操作工艺简单易行，省时省力，安全环保，减少成本。

Method for inactivating recombinant baculovirus

The invention discloses a method for inactivating recombinant baculovirus, which is used for inactivating the recombinant baculovirus contacting hydrogen peroxide. The use of hydrogen peroxide as a inactivating agent can effectively inactivate recombinant baculovirus, the operation process is simple and convenient, time saving, labor saving, safety, environmental protection and cost reduction.

【技术实现步骤摘要】
一种用于灭活重组杆状病毒的方法
本专利技术涉及灭活病毒
更具体地，涉及一种用于灭活重组杆状病毒的方法。
技术介绍
重组昆虫杆状病毒-昆虫细胞表达系统自SmithGE等于1983年利用AcNPV成功表达人β干扰素以来，在30多年的时间里已有数千个基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达。这些高活性的表达产物在人、禽的多种传染病的防治、肿瘤疫苗、信号传导、细胞的增殖与分化、酶学等方面的研究发挥了不可替代的作用。因此它已被公认为当今基因工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。VLPs(VirusLikeParticles)是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，不含有病毒核酸，不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，称为似病毒颗粒。由于重组昆虫杆状病毒表达系统易于筛选，安全性好，产物成本低，表达水平高，表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可使蛋白产物保持天然结构、生物活性和免疫活性，且易于大规模生产外源蛋白，因此被认为是表达VLP的最佳表达系统。似病毒颗粒(VLPs)保留了天然病毒粒子的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫性强。能激发体液免疫和细胞免疫应答。VLP作为一种新型疫苗，不仅克服了传统疫苗的不足，也弥补了其他基因工程疫苗的缺憾，是目前最有发展前景、最安全的预防兼治疗的候选疫苗。传统的灭活疫苗制备是先大量生产病原活病毒，然后用化学试剂杀死(灭活)这些病毒制成抗原，再乳化成疫苗。常用的灭活化学试剂是甲醛和β-丙内酯。大量科学实验已经表明，这两种化学试剂有害于人体健康，是潜在的人类和动物的致癌物质。例如，对大鼠的研究表明，甲醛诱导其鼻腔的鳞状细胞癌。对小鼠的实验显示，β-丙内酯能诱导产生鳞状细胞癌，淋巴瘤和肝细胞瘤。似病毒颗粒(VLPs)疫苗属基因工程苗，是用重组杆状病毒作为载体来表达制备的。尽管重组杆状病毒不是致病的病原体，但仍然需要在完成了似病毒颗粒抗原的制备后，将其灭活处理。重组杆状病毒容易被灭活，目前最常用的方法是用二乙烯亚胺(BEI)来进行处理。如拜耳公司用重组杆状病毒生产的猪瘟病毒疫苗、勃林格殷格翰动物保健公司生产的猪圆环病毒2型VLP疫苗等均采用BEI灭活VLP上清中残存的重组杆状病毒。二乙烯亚胺(BEI)灭活处理重组杆状病毒也有其客观不足之处：1.二乙烯亚胺(BEI)需要由2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)经NaOH处理环化后获得。只有二乙烯亚胺(BEI)具有杀灭重组杆状病毒的作用。而BEA有一定的毒性，其环化处理需要在通风橱柜中进行，增加了生产工序和成本。2.二乙烯亚胺(BEI)灭活结束时，需要加入过滤除菌的硫代硫酸钠(Na2S2O3)来终止灭活反应。因此当整个灭活过程结束后，VLP上清液中有大量的白色沉淀析出，需要去除之，以便杜绝给后续的疫苗产品带来潜在问题。3.二乙烯亚胺(BEI)灭活需时较长，从而相对增加了疫苗制备的时间和成本。因此，本专利技术则是要提供合适的灭活重组杆状病毒的方法，即工艺简单，省时省力，又能降低成本的有效灭活方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灭活重组杆状病毒的方法，该方法操作简单易行，省时省力，安全环保，成本低。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种用于灭活重组杆状病毒的方法，该方法为使所述重组杆状病毒接触氧化剂进行灭活。优选地，所述氧化剂为过氧化氢溶液。优选地，所述过氧化氢溶液的浓度为0-20％(w/w)；进一步优选地，所述过氧化氢溶液的浓度为0-1％(w/w)；最优选的，所述过氧化氢溶液的浓度为0.03-0.3％(w/w)。优选地，所述重组杆状病毒与氧化剂接触的时间为0-48h；优选地，所述病毒与氧化剂接触的时间为0-24h，更优选地所述病毒与氧化剂接触的时间为5min、0.5h、3h或18h。优选地，所述重组杆状病毒与氧化剂接触的温度为0-45℃；优选地，所述病毒与氧化剂接触的温度为27℃、25℃或4℃。优选地，所述重组杆状病毒为在制备似病毒颗粒疫苗抗原、亚单位蛋白疫苗抗原、疫苗辅助增强物、治疗性蛋白复合剂中所用表达系统中的重组杆状病毒及用重组杆状病毒自身做为疫苗抗原、疫苗辅助增强物、治疗性蛋白复合剂和各种检测试剂。优选地，使用催化酶或化学抑制剂终止灭活重组杆状病毒的反应。优选地，所述催化酶为来源于各种动物、植物和微生物的催化酶；所述化学抑制剂为具有分解过氧化氢功能的催化剂。优选地，所述催化酶为牛肝源催化酶；所述化学抑制剂为二氧化锰。优选地，所述催化酶终止反应的温度为25-30℃。本专利技术的有益效果如下：本专利技术使用过氧化氢(H2O2)作为灭活剂，能有效地灭活重组杆状病毒，操作工艺简单易行，省时省力，安全环保，减少成本；与使用甲醛，丙内酯，紫外线照射和/或加热等方法灭活病原体相比较，过氧化氢最大的优势是不会破坏抗原蛋白的表位空间构象，因而保证了疫苗抗原的有效性。用过氧化氢灭活VLP上清液中的重组杆状病毒，不会使上清液产生大量的白色沉淀，保证了后续VLP疫苗产品的有效制备和使用；且过氧化氢商品价格便宜，低浓度使用很安全，对人畜无害。经常应用于人们日常生活和医疗外科手术等场合的消毒杀菌。附图说明图1为禽流感VLP上清样品灭活后血凝效价比较的示意图；图2为新城疫VLP上清样品灭活后血凝效价比较的示意图；图3杆状病毒滴度示意图；图4为过氧化氢灭活法不影响禽流感VLP疫苗的免疫原性的示意图。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例和附图对本专利技术做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。实施例1过氧化氢(H2O2)灭活VLP上清液中的重组杆状病毒，不会使上清液产生大量白色沉淀颗粒。实验步骤如下：(1)按表1中的量，将昆虫细胞培养液—Sf900II新鲜培养液、VLP上清样品一、VLP上清样品二分别加入到做好标记的1.5mL塑料管中，然后向各管中加入医用浓度为3％(w/w)的过氧化氢溶液，再加入纯净水至终体积600μL，混匀，放在27℃孵育；(2)当孵育至18h，各管分别加入4μL牛肝源催化酶(Sigma)，混匀，终止灭活；(3)取混匀好的各样品100μL，分别加入到一个96孔板的各孔中，做好标记，放入读盘机，设OD600nm读数。实验结果：表1所列的OD值显示，实验组中，在加了过氧化氢溶液和牛肝源催化酶孵育后，无论是新鲜的昆虫细胞培养液Sf900II还是VLP上清样品一、VLP上清样品二，与没加过氧化氢溶液和牛肝源催化酶的空白对照组比较，OD值都没有差异，说明无沉淀颗粒析出。表1实施例2低浓度(本实施例中的低浓度为0-1％(w/w))的过氧化氢灭活法能保持VLP疫苗抗原蛋白的自然结构。实验步骤如下：(1)按表2所示的量，将禽流感VLP上清样品，分别加入到做好标记的1.5ml塑料管中，然后向各管中加入医用浓度为3％(w/w)的过氧化氢溶液，再加入纯净水至终体积600μL，混匀，27℃孵育3h；(2)另取一批1.5mL塑料管，完全重复上面的加样方法，混匀后，27℃孵育18h；(3)当孵育至3h，向步骤(1)的各管中分别加入4μL牛肝源催化酶，混匀，终止灭活；(4)当孵育至18h，向本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于灭活重组杆状病毒的方法，其特征在于：该方法为使所述重组杆状病毒接触氧化剂进行灭活。

【技术特征摘要】
1.一种用于灭活重组杆状病毒的方法，其特征在于：该方法为使所述重组杆状病毒接触氧化剂进行灭活。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧化剂为过氧化氢溶液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述过氧化氢溶液的浓度为0-20％(w/w)；优选地，所述过氧化氢溶液的浓度为0-1％(w/w)；更优选的，所述过氧化氢溶液的浓度为0.03-0.3％(w/w)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组杆状病毒与氧化剂接触的时间为0-48h；优选地，所述病毒与氧化剂接触的时间为0-24h，更优选地所述病毒与氧化剂接触的时间为5min、0.5h、3h或18h。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组杆状病毒与氧化剂接触的温度为0-45℃；优选地，所述病毒与氧化剂接触的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许雁，诺曼·吉利卡，李改，
申请(专利权)人：诺华生物科技武汉有限责任公司，许雁，
类型：发明
国别省市：湖北,42