猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗技术

本发明专利技术提供了一种猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗,属于生物工程及病毒疫苗技术领域。其中猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒选用逆转录病毒的Gag前体蛋白做为基质蛋白，猪瘟病毒囊膜蛋白E0和E2做为表面膜蛋白，自组装成理想的且具功能性的病毒样颗粒，克服了亚单位蛋白疫苗的弱点，有效提高了疫苗的免疫原性、安全性和稳定性；该嵌合型病毒样颗粒通过构建表达载体转染细胞的方式能大量制备；本发明专利技术的猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒可应用于制备预防猪瘟疫病的疫苗、制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂，具有较好的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗
本专利技术涉及生物工程及病毒疫苗
，具体而言，涉及猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗。
技术介绍
猪瘟是由猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，目前可分为急性、亚急性、慢性和非典型猪瘟。急性猪瘟由强毒株引发，一般导致猪的高发病率和高死亡率。除引起败血症外，猪瘟病毒还可引起一系列临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸形、慢性营养消耗、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统病变，并容易继发和并发细菌或其他病毒感染。猪瘟给世界养猪业造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织将其列入OIE疫病名录，为须申报的动物传染病，我国也将其列为一类动物传染病。猪瘟病毒为黄病毒科瘟病毒属成员，病毒粒子呈球形，是有囊膜的单股正链RNA病毒。基因组全长12.3kb，含有一个大的开放阅读框，该阅读框编码一个含3898个氨基酸的多聚蛋白，此多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用下，加工形成4个结构蛋白(C、E0、E1和E2)和8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中囊膜糖蛋白E0和E2是两个保护性抗原蛋白，可以诱导机体产生抗猪瘟的保护性免疫抗体。目前国际公认的猪瘟病毒被分为三个基因型共十个基因亚型。我国是生猪养殖大国，无论是饲养量还是猪肉产量均位居世界第一。我国居民肉食消费约65％来源于猪，仅生猪养殖、屠宰和猪肉制品产值已超过2万亿元。养猪业已经成为我国农业和农村经济的支柱产业，是保障食品安全的基础产业。近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势，一些宣布已消灭猪瘟的国家(如法国、荷兰、德国、比利时等)又见猪瘟复发的报道。猪瘟病毒仅有1个血清型且变异率相对较小，因此，疫苗接种仍是大多数国家防控猪瘟的主要措施。目前我国生产及使用的猪瘟疫苗为传统的猪瘟弱毒疫苗，然而，现代猪瘟的流行趋势发生了很大变化，呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存，隐性感染和持续感染并现，且免疫失败的现象时有发生。这种新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战，加上传统疫苗无法区分病毒感染和免疫的动物(DIVA)，已经不能满足现代防控和根除猪瘟的要求了。据报道，近年来研制的新型疫苗包括核酸疫苗、病毒活载体疫苗、基于蛋白/肽的疫苗、基因缺失疫苗等。虽然近年来研制的新型猪瘟疫苗具有各自的优势，但也存在一定的缺陷。如核酸疫苗诱导产生抗体的速度慢，接种剂量大，有整合和转化染色体的潜在危险；病毒活载体疫苗对人类而言，因还不完全了解病毒的自然发生及变异机制，无法控制该类病毒的未来走向；亚单位疫苗免疫原性通常要比病毒颗粒抗原差，不能提供有效保护；基因缺失疫苗通常为弱毒活苗，其长期使用可能会改变猪瘟病毒原有的生态环境和病毒群落，使猪瘟流行毒株向远离疫苗毒的方向演化，且很难达到现代防控和根除猪瘟疫病的要求。因此，开发一种安全、高效的新型猪瘟疫苗对于预防和控制猪瘟具有重要意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述不足，本专利技术提供了猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗。其中猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒选用逆转录病毒的Gag前体蛋白做为基质蛋白，猪瘟病毒囊膜蛋白E0和E2做为表面膜蛋白，制备出理想的且具功能性的病毒样颗粒，克服了亚单位蛋白疫苗的弱点，有效提高了疫苗的免疫原性、安全性和稳定性；该嵌合型病毒样颗粒通过构建表达载体转染细胞的方式能大量制备；本专利技术的猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒可应用于制备预防猪瘟疫病的疫苗、制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一目的是提出一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，所述嵌合型病毒样颗粒包含逆转录病毒的Gag前体蛋白、猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2。优选地，所述猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒基因亚型株；进一步优选地，所述猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒2.1基因亚型株。优选地，编码猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。优选地，所述逆转录病毒的Gag前体蛋白为鸡白血病病毒前体蛋白ALV-Gag或人免疫缺陷病毒前体蛋白HIV-Gag。进一步优选地，编码鸡白血病病毒前体蛋白ALV-Gag的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，编码人免疫缺陷病毒前体蛋白HIV-Gag的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。本专利技术的第二目的是提出上述任一项所述的猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的制备方法，用表达所述猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的重组载体转染细胞，得到细胞培养液，回收并纯化所述细胞培养液，获得所述猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒。优选地，所述细胞为昆虫细胞，所述重组载体为杆状病毒重组载体。本专利技术的第三目的是提出一种疫苗，所述疫苗包含上述任一项所述的猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒。优选地，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自水包白油型佐剂、角鲨烯佐剂、植物油佐剂或弗氏佐剂中至少一种。本专利技术的第四目的是提出上述任一项所述的猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒在制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂中的应用，所述制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒中的任一种。本专利技术的技术方案的原理为：1.猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的生成原理：将作为基质蛋白的逆转录病毒的Gag前体蛋白和将作为表面膜蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E0和E2，构建于昆虫杆状病毒的表达载体质粒内，并使其重组入昆虫杆状病毒的遗传物质DNA内，利用宿主昆虫细胞表达这些外源蛋白，然后自动组装成不含任何猪瘟病毒遗传物质的病毒样颗粒，并释放入细胞培养液中。2.猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的免疫原理：猪瘟病毒的囊膜糖蛋白E0和E2是两个保护性抗原蛋白，可以诱导机体产生抗猪瘟的保护性免疫抗体。猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒作为疫苗抗原体，其颗粒表面上带有的E0和E2囊膜蛋白能诱发免疫应答；同时，由于病毒样颗粒保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫效果更显著；猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒疫苗具有野生病毒的整体外部特征，却不具有病毒的遗传物质，因此，病毒样颗粒疫苗无需进行任何化学灭活，其表面糖蛋白的构象空间没被破坏，与野生病毒一致。因此这种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒疫苗，真正达到了既安全又有效的目的。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术选用逆转录病毒的Gag前体蛋白做为基质蛋白、猪瘟病毒囊膜蛋白E0和E2做为表面膜蛋白，制备出理想的且具功能性的病毒样颗粒，该病毒样颗粒能诱发免疫应答；由于病毒样颗粒具有天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，却不具有病毒的遗传物质，病毒样颗粒疫苗无需化学灭活，其表面糖蛋白的构象空间没被破坏，与野生病毒一致，因而其具备更好的抗原性、安全性和稳定性。且制备得到的疫苗抗体效价高，效果明显；适用范围广，可作为标记疫苗使用，具有较好的实际应用价值。(2)本专利技术用表达猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒的重组杆状病毒质粒载体转染昆虫细胞，得到细胞培养液，回收并纯化所述细胞培养液，获得所述猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，其特征在于，所述嵌合型病毒样颗粒包含逆转录病毒的Gag前体蛋白、猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2。

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，其特征在于，所述嵌合型病毒样颗粒包含逆转录病毒的Gag前体蛋白、猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2。2.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，其特征在于，所述猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒基因亚型株；优选地，所述猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒2.1基因亚型株。3.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，其特征在于，编码猪瘟病毒表面囊膜蛋白E0的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码猪瘟病毒表面囊膜蛋白E2的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，其特征在于，所述逆转录病毒的Gag前体蛋白为鸡白血病病毒前体蛋白ALV-Gag或人免疫缺陷病毒前体蛋白HIV-Gag。5.根据权利要求4所述的一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，其特征在于，编码鸡白血病病毒前体蛋白ALV-Gag的核苷酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：许雁，诺曼﹒吉利卡，李改，夏燕，
申请(专利权)人：诺华生物科技武汉有限责任公司，许雁，
类型：发明
国别省市：湖北,42