一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法技术

本发明专利技术属于小分子物质检测领域，具体涉及一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法；本发明专利技术首先通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的辣根过氧化物酶与加入的TMB/H

【技术实现步骤摘要】
一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法
本专利技术属于小分子物质检测领域，具体涉及一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法。
技术介绍
微流控纸芯片作为新兴领域，具有以下三点优点:(1)在纸芯片上实现了进样、流通、检测等全部实验流程，使复杂的实验操作集成到一张小小芯片上，通过设计通道尺寸、微阀门、微零件等的搭配组合完成整体自动化；(2)检测试剂、样本量需求低，一般几微升就可以完成检测，缩短了配样时间和样品消耗，对于珍贵稀少的样品检测更加方便，纸张价格低廉，来源丰富，制作过程简单环保，可以重复使用，缩减了实验成本；(3)由于纸芯片的集成化使得实验操作简便实验消耗少，实验过程基本不产生污染物质，在纸芯片上进行的反应经过适当降解处理后可以直接当普通垃圾处理，对环境友好，对实验人员的健康损坏性小。此外，比色检测法是微流控纸芯片检测中最早、最常用、最简便直观的检测方法，主要通过待测物质和显色剂发生颜色反应，据颜色的深浅强弱来判断待测物质的含量。由于颜色的可视性，此法可直观的进行半定量分析，后期可以通过图像灰度准确定量检测。抗生素被广泛应用于疾病防治中，但是动物饲料中抗生素的滥用，不可避免地导致蜂蜜、鸡蛋、鱼、奶等动物源性食品中抗生素的残留。其中，四环素(TET)的残留会引起腹痛、腹泻、胀气、呕吐；氯霉素(CAP)的残留会引起致命的骨髓抑制和再生障碍性贫血。因此，我国规定了牛奶和鱼类中的TET最高残留限量(MaximumResidueLimit，MRL)为100μg/kg，动物源性食品中禁止使用CAP。目前，已经开发了各种昂贵和复杂的方法来测定抗生素，如色谱技术、光学传感器、电化学传感器和生物传感器，常用的主要为仪器分析方法，包括HPLC、LC-MS等方法，具有准确性好、灵敏度高的优点，但这些技术必然需要专业仪器，前处理繁琐，操作成本高。本专利技术基于纸芯片比色对抗生素进行定量检测可以改进这些不足，有效实现大量样本的快速、灵敏、便捷现场检测。
技术实现思路
为了解决现有检测抗生素方法的前处理复杂、操作成本高、耗时长、需要专业仪器的问题，本专利技术的目的是提供一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，首先通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的辣根过氧化物酶与加入的TMB/H2O2显色底物溶液发生反应产生颜色变化，且显色深浅与抗生素的含量成反比。所述基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法按照以下步骤进行：一、制备纸芯片：①设计纸芯片的图案为圆阵列，圆内部为白色，周围为黑色，三个定位符位于纸芯片的边缘作为位置校正，三种标准颜色(红、绿、蓝)的实心圆在纸芯片的底端作为颜色校正；②用喷蜡打印机打印设计好的纸芯片图案，再将打印好的纸基置于120℃的加热板上加热1min后冷却至室温即可；③在圆阵列白色区域滴加40μL羧甲基纤维素钠溶液，室温反应20min后，将纸基干燥后，滴加20μL含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液，室温反应30min后，将纸基干燥，滴加25μL抗原至不同检测区中，室温反应5min后，将纸基干燥，滴加20μL含有1％牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液进行封闭，室温反应5min后，将纸基干燥后，最终将制备好的纸芯片保存在4℃备用；二、定量检测四环素和氯霉素：①将步骤一制备好的纸芯片水平悬空放置，并分别取25μL待测溶液、5μL单克隆抗体和5μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗混合后滴加至纸芯片的不同检测区中，室温反应5min；所述待测溶液包括空白溶液即去离子水、含有四环素或者氯霉素标准品的标准溶液和经样品处理后的样品溶液；②滴加40μLPBST缓冲液至检测区域中，放置吸水纸在纸芯片下层吸掉多余的物质，重复三次；③滴加3μLTMB/H2O2显色底物溶液至检测区域中，进行显色反应1-5min，加入空白溶液的对照孔的颜色趋于深蓝色，加入含有四环素或者氯霉素溶液的样品孔的颜色趋于淡蓝色甚至白色，即检测区域的显色深浅与抗生素的含量成反比，若对照孔没有显色出现，则检测结果无效；④用图片采集设备对显色后的纸芯片进行图片采集，再通过图像处理软件分析获得各个检测区域的颜色强度数据，以标准溶液中抗生素的浓度为横坐标、对应的颜色强度数据为纵坐标，绘制工作曲线并拟合得到标准曲线方程，由标准曲线方程和待测样品的颜色强度数据，计算得到待测样品溶液中抗生素的含量。本申请在纸芯片上成功修饰蛋白并且修饰步骤相对现有方法简单，我们的修饰蛋白是首先在纸芯片上修饰上羧基，再通过EDC/NHS的反应将蛋白的氨基与纸芯片上的羧基进行偶联，从而将蛋白固定在纸芯片上，该反应原理较成熟并且蛋白结合较牢固，其他固定蛋白技术需要额外的仪器或者结合效率不高。作为本申请的优选技术方案，步骤一①中所述的纸芯片的图案为直径和间距都为6mm的4×4圆阵列，白色区域为亲水区，其他区域为疏水区。本申请的纸芯片的制备实现了高通量的检测，一张纸上可以有许多检测孔，而现有技术一般只能在单个纸芯片上检测单个或者少数样品。作为本申请的优选技术方案，步骤一③中所述的不同检测区分别为检测四环素区域和检测氯霉素区域。作为本申请的优选技术方案，步骤一③中所述的抗原为四环素-BSA抗原或者氯霉素-BSA抗原，稀释度分别为1:100～1:2000、1:50～1:3200。优选的，所述四环素-BSA抗原的稀释度为1:400，所述氯霉素-BSA抗原的稀释度为1:800。作为本申请的优选技术方案，步骤二①中所述的混合物滴加至纸芯片后，室温反应5min。作为本申请的优选技术方案，步骤二①中所述的单克隆抗体为抗四环素单克隆抗体或者氯霉素单克隆抗体；所述抗四环素单克隆抗体的稀释度为1:40～1:320；所述氯霉素单克隆抗体的稀释度为1:80～1:640。优选的，所述抗四环素单克隆抗体和氯霉素单克隆抗体的稀释度都为1:160。作为本申请的优选技术方案，步骤二①中，样品为牛奶或者鱼肉。作为本申请的优选技术方案，步骤二②中所述的PBST缓冲液为含有0.05％吐温的10mMPBS缓冲液。作为本申请的优选技术方案，步骤二③中所述的滴加TMB/H2O2显色底物溶液后，显色反应3min。作为本申请的优选技术方案，步骤二④中所述的颜色强度数据具体为红色通道的强度数据。作为本申请的优选技术方案，步骤二④中图片采集设备为扫描机、相机或手机等。作为本申请的优选技术方案，所述图像处理软件为ImageJ、PS等。本专利技术所述纸芯片能够实现对0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，首先通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的辣根过氧化物酶与加入的TMB/H

【技术特征摘要】
1.一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，首先通过喷蜡打印技术和生物修饰制备纸芯片，然后基于竞争酶联免疫吸附原理，样品中的四环素或者氯霉素与固定在纸芯片上的对应抗原竞争结合相对应的特异性单抗，又与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗结合，最终固定在纸芯片上的辣根过氧化物酶与加入的TMB/H2O2显色底物溶液发生反应产生颜色变化，且显色深浅与抗生素的含量成反比。


2.根据权利要求1所述的一种基于纸芯片比色的同时快速定量检测四环素和氯霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
一、制备纸芯片：
①设计纸芯片的图案为圆阵列，圆内部为白色，周围为黑色，三个定位符位于纸芯片的边缘作为位置校正，三种标准颜色的实心圆在纸芯片的底端作为颜色校正；
②用喷蜡打印机打印设计好的纸芯片图案，再将打印好的纸基置于120℃的加热板上加热1min后冷却至室温即可；
③在圆阵列白色区域滴加40μL羧甲基纤维素钠溶液，室温反应20min后，将纸基干燥后，滴加20μL含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，室温反应30min后，将纸基干燥，滴加25μL抗原至不同检测区中，室温反应5min后，将纸基干燥，滴加20μL含有1%牛血清蛋白的PBS缓冲液进行封闭，室温反应5min后，将纸基干燥，最终将制备好的纸芯片保存在4℃备用；
二、定量检测四环素和氯霉素：
①将步骤一制备好的纸芯片水平悬空放置，并分别取25μL待测溶液，5μL单克隆抗体和5μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗混合后滴加至纸芯片的不同检测区中，室温反应；所述待测溶液包括空白溶液、含有四环素或者氯霉素标准品的标准溶液以及经样品处理后的样品溶液；
②滴加40μLPBST缓冲液至检测区域中，放置吸水纸在纸芯片下层吸掉多余的物质，重复三次；
③滴加3μLTMB/H2O2显色底物溶液至检测区域中，进行显色反应1~5min，加入空白溶液的对照孔的颜色趋于深蓝色，加入含有四环素或者氯霉素溶液的样品孔的颜色趋于淡蓝色甚至白色，即检测区域的显色深浅与抗生素的含量成反比，若对照孔没有显色出现，则检测结果无效；
④用图片采集设备对显色后的纸芯片进行图片采集，再通过图像处理软件分析获得各个检测区域的颜色强度数据，以标准溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘斐，王欣，李嘉豪，张越，王绶玙，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32