一种用于定量检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于定量检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条及其制备方法，试纸条从下至上依次包括PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合垫包被有纳米量子点荧光微球标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，质控线包被羊抗鼠IgG。本发明专利技术制备方法简单，步骤易于操作，制备得到的荧光试纸条能够现场快速检测可疑淋巴结的甲状腺球蛋白Tg值，辅助诊断甲状腺乳头状癌的淋巴结转移，本发明专利技术的试纸条还能够用于术前、术中、术后随访的淋巴结细针穿刺抽吸洗脱液测Tg值，辅助可疑颈部淋巴结甲状腺乳头状癌转移的明确诊断。本发明专利技术试纸条的使用方法简便，检测速度快，特异性强。

【技术实现步骤摘要】
一种用于定量检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条及其制备方法
本专利技术涉及一种用于检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条及其制备方法，属于生物试剂

技术介绍
甲状腺癌伴颈部淋巴结转移者的手术方式及后续治疗、随访完全不同，若常规进行颈部淋巴结预防性清扫，则弊大于利。在甲状腺癌术后随访中，淋巴结发生转移的再发率为3％-30％，诊断率为27％-46％。因此，早期鉴别颈部淋巴结是否转移是非常重要的。尽管US-FNA对颈部转移淋巴结的诊断非常特异，但其敏感性较低，尤其是对细胞量较少的样本。所以，早期发现颈部淋巴结转移是患者个体化诊治的重点和难点之一。甲状腺球蛋白(Tg)是甲状腺滤泡上皮细胞分泌的大分子糖蛋白，正常淋巴结内检测不到Tg，若在淋巴结组织内检测出高浓度Tg，应高度警惕甲状腺癌转移的可能性。细针穿刺洗脱液甲状腺球蛋白(thyroglobulininfine-needleaspiratefluid，FNA-Tg)测定是近几年发展的一项新技术，其操作简便、准确，可在一定程度上避免病理诊断的主观性。在国外获得认可并广泛应用于临床，但在国内，FNA-Tg技术尚未引起足够的重视。现有美国及欧洲甲状腺协会将FNA-Tg监测列为甲状腺癌术前术后淋巴结评估的辅助诊断方法，为颈部淋巴结清扫策略的制定提供新的依据。采用荧光微球免疫层析技术是以免疫层析为基础建立的免疫标记技术，其特点是以荧光微球为显色标记物与抗原、抗体特异性反应相结合，结合荧光定量检测仪可定量检测检测甲状腺球蛋白的浓度。该检测方法结果判断简单，检测时间短，灵敏度高特异性强，适合现场检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够快速对细针穿刺淋巴结洗脱液中的TG含量进行定量分析试纸条，其灵敏度高，可为临床早期发现颈部淋巴结转移的手术方案制定提供参考指标。本专利技术采用如下技术方案：一种用于定量检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条，从下至上依次包括PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合垫包被有纳米量子点荧光微球标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述质控线包被羊抗鼠IgG。用于检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条的制备方法，包括如下步骤(1)样品垫预处理：将玻璃纤维膜浸泡于样品垫缓冲液中完全浸透，取出沥干并烘干备用；(2)结合垫的预处理：将另一块玻璃纤维膜浸泡于结合垫缓冲液中直至完全浸透，取出沥干并烘干备用；(3)荧光微球标记甲状腺球蛋白抗体的制备：取纳米量子点荧光微球，加入反应缓冲液混匀后加入EDC溶液离心去上清液，将反应缓冲液溶解，超声重悬；取抗甲状腺球蛋白抗体加入到上述重悬液中，震荡混匀，超声处理，室温混匀反应；离心去上清液后加入BSA溶液离心去上清，沉淀溶解超声，加荧光微球复溶液保存，形成甲状腺球蛋白抗体荧光微球结合物溶液；(4)结合垫制备：将步骤(3)中得到的甲状腺球蛋白抗体荧光微球结合物溶液用划膜喷金仪喷涂于处理过的结合垫上，喷量5-10μl/cm，37℃干燥过夜，形成甲状腺球蛋白荧光微球结合垫备用；(5)包被膜的制备：将甲状腺球蛋白包被抗体用包被缓冲液稀释至1-2mg/mL，羊抗鼠IgG稀释至1-2mg/ml同时包被于硝酸纤维素膜上，然后将硝酸纤维素膜黏贴至PVC板上；(6)试纸条的组装：分别将吸水垫、结合垫和样品垫裁切至合适尺寸，然后从上至下依次按吸水垫、结合垫、样品垫粘贴到包被好的PVC板上组装成大板。进一步的，所述纳米量子点荧光微球的粒径大小为100-200nm。进一步的，所述步骤(3)中的荧光微球复溶液中包含质量百分数为0.242％的Tris，质量百分数为0.1-2％的BSA，质量百分数为10-20％的蔗糖，质量百分数为1-5％的海藻糖，质量分数为0.05-0.5％的Proclin300，调节pH值至7.5-8.5。进一步的，所述步骤(1)中的样品垫处理液包括质量百分数为0.6％的Tris，质量百分数0.1-2％的酪蛋白钠,质量百分数0.1-1％的PVP，体积百分数0.1-2％的Tween-20，体积百分数0.05-0.5％的Proclin300，纯化水溶解至100mL，调节pH至8.2。进一步的，所述步骤(2)中的结合垫缓冲液包括质量百分数为0.6％的Tris，质量百分数为0.1-2％酪蛋白钠,质量百分数为0.1-1％的PVP，体积百分数为0.05-0.5％的Proclin300，纯化水溶解至100mL，调节pH值至8.2。进一步的，所述步骤(3)中每毫克荧光微球加入2-8ug抗甲状腺球蛋白抗体。进一步的，所述步骤(3)中采用反应缓冲液为pH5.5-6的MES溶液或pH6.5-7.5的PBS缓冲液。进一步的，所述步骤(3)中的荧光微球溶液加入反应缓冲液和10mg/mlEDC室温混匀0.5-1h后，10000-15000rpm离心10-30min，沉淀用0.05M/LMES缓冲液或0.02M/LPBS溶解，超声重悬；取抗甲状腺球蛋白抗体1-20μl加入到上述重悬液中，震荡混匀，超声10-12s，室温混匀反应0.5-1h；于10000-15000rpm离心10-30min，加入MES或pbs缓冲液溶解，超声重悬；加入10％BSA，室温混匀反应1-2h；10000-15000rpm离心10-30min，沉淀用纯化水溶解超声，加荧光微球复溶液保存，形成甲状腺球蛋白单克隆抗体荧光微球结合物溶液。本专利技术的有益效果：本专利技术制备方法简单，步骤易于操作，采用量子点纳米微球一步法标记，时间更短，操作步骤更少，结合稳定，灵敏度高，抗干扰能力更强。制备得到的荧光试纸条能够现场快速检测可疑淋巴结的甲状腺球蛋白Tg值，辅助诊断甲状腺乳头状癌的淋巴结转移，本专利技术的试纸条还能够用于术前、术中、术后随访的淋巴结细针穿刺抽吸洗脱液测Tg值，辅助可疑颈部淋巴结甲状腺乳头状癌转移的明确诊断。本专利技术试纸条的使用方法简便，检测速度快，特异性强。能够定量检测甲状腺球蛋白，充分满足了临床的需要，具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术中检测的甲状腺球蛋白的标准曲线。图2为本专利技术制备得到的荧光试纸条使用状态示意图。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术实施例中采用的材料玻纤膜外购于上海良信；BSA外购于BOVOGEN。一种用于定量检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条，从下至上依次包括PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合垫包被有纳米量子点荧光微球标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，质控线包被羊抗鼠IgG。具体组装切割方法如下所示：需在湿度小于等于30％条件下操作(1)将吸水垫用裁条机切割成20*300mm备用；(2)将结合垫用裁条机切割成8*300mm备用；(3)将样品垫用裁条机切割成17*300mm备用；(4)依次将吸水垫、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条，其特征在于：从下至上依次包括PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合垫包被有纳米量子点荧光微球标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述质控线包被羊抗鼠IgG。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于定量检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条，其特征在于：从下至上依次包括PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合垫包被有纳米量子点荧光微球标记的一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线包被另一种抗甲状腺球蛋白抗体，所述质控线包被羊抗鼠IgG。


2.权利要求1所述的用于检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤
(1)样品垫预处理：将玻璃纤维膜浸泡于样品垫缓冲液中完全浸透，取出沥干并烘干备用；
(2)结合垫的预处理：将另一块玻璃纤维膜浸泡于结合垫缓冲液中直至完全浸透，取出沥干并烘干备用；
(3)荧光微球标记甲状腺球蛋白抗体的制备：取纳米量子点荧光微球，加入反应缓冲液混匀后加入EDC溶液离心去上清液，将反应缓冲液溶解，超声重悬；取抗甲状腺球蛋白抗体加入到上述重悬液中，震荡混匀，超声处理，室温混匀反应；离心去上清液后加入BSA溶液离心去上清，沉淀溶解超声，加荧光微球复溶液保存，形成甲状腺球蛋白抗体荧光微球结合物溶液；
(4)结合垫制备：将步骤(3)中得到的甲状腺球蛋白抗体荧光微球结合物溶液用划膜喷金仪喷涂于处理过的结合垫上，喷量5-10μl/cm，37℃干燥过夜，形成甲状腺球蛋白荧光微球结合垫备用；
(5)包被膜的制备：将甲状腺球蛋白包被抗体用包被缓冲液稀释至1-2mg/mL，羊抗鼠IgG稀释至1-2mg/ml同时包被于硝酸纤维素膜上，然后将硝酸纤维素膜黏贴至PVC板上；
(6)试纸条的组装：分别将吸水垫、结合垫和样品垫裁切至合适尺寸，然后从上至下依次按吸水垫、结合垫、样品垫粘贴到包被好的PVC板上组装成大板。


3.如权利要求2所述的用于检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条的制备方法，其特征在于：所述纳米量子点荧光微球的粒径大小为100-200nm。


4.如权利要求2所述的用于检测甲状腺球蛋白的荧光试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的荧光微球复溶液中包含质量百分数为0.242％的Tris，质量百分数为0.1-2％的BSA，质量百分数为10-20％的蔗糖，质量百分数为1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：周锋盛，丁炎，张雨，刘元，端木家喜，吴鹏西，
申请(专利权)人：无锡市人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32